[发明专利]草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及由草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S9基因编码的重组VP6抗原蛋白及其应用。

背景技术

由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业造成巨大经济损失，严重制约着我国草鱼养殖的健康发展。GCRV具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60nm～70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成，根据其基因节段的大小，将其基因组按分子量大小分为3个组，分别命名为L1-L3、M4-M6和S7-S11。这11个RNA节段可以编码12种多肽蛋白，但具体哪些基因编码结构蛋白，哪些编码非结构蛋白以及各编码蛋白的功能如果还没有证实。由于病毒的基因组的分节段特性，不同毒株之间可发生重配而产生高度变异，使得草鱼呼肠孤病毒的毒株较为复杂，目前已报道有30多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV096、GCRV829、H962、ZV-8802、ZV-8909、GCHV-854、GCRV-HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD108、106、109、HuNan1307等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。根据现有的分离株基因序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因型，即GCRVⅠ型(代表株为GCRV-873与GCRV-JX09-01)、GCRVⅡ型(代表株为GCRV-HZ08)和GCRVⅢ型(代表株为GCRV-104为)。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有单独感染，也有混合感染,以HZ08株为代表的GCRVⅡ型是目前导致草鱼出血病流行和爆发的主要株型。

目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防，草鱼出血病细胞灭活疫苗与细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。但灭活疫苗的免疫原性比较差，需要足够大的量才能引起免疫应答，而大剂量又可引起局部或全身反应，并且所获得的免疫应答比较短暂，需要多次注射来增强免疫应答，而灭活疫苗的生产成本又比较高；细胞弱毒疫苗存在毒力返强的危险，有散毒的风险。和传统疫苗相比，基因工程疫苗存在较多有点，其抗原成分单一、免疫原性强，能够刺激机体产生较强的体液和细胞免疫应答，持续时间长；可规模化生产，成本相对低廉。此外，一种疫苗的免疫效果如何，需要合适的方法来检测和评价。通过免疫学方法来检测免疫动物特异性抗体的有无及抗体效价的高低是目前最为简便和有效的方法。由于草鱼呼肠孤病毒免疫原性比较差，至今还没有一种有效的免疫学诊断方法，尤其是缺乏评价疫苗免疫效果的血清学检测方法。

发明内容

经研究表明：GCRVⅡ型S9基因节段能够编码一个长达418个氨基酸的蛋白质(VP6)，分子量预测为42.86KDa，BLASTp的结果显示该VP6蛋白与水生呼肠孤病毒VP6蛋白(S8编码)、哺乳动物(MRV)σ2(S2编码)、禽呼肠孤病毒(ARV)σA(S2编码)具有较高的同源性，与美国草鱼呼肠孤病毒(AGCRV)、草鱼呼肠孤病毒873株(GCRV873)、水生呼肠孤病毒A(Aqu A)、美洲金体鳊呼肠孤病毒(GSV)、MRV血清型2、MRV血清型3和MRV血清型1的同源性分别为：25％、26％、25％、26％、20％、20％和20％，相似性分别为：37％、39％、37％、40％、36％、36％和37％，与ARV的同源性和相似性大约为24％和38％。初步认为HZ08S9的编码蛋白VP6与MRV的σ2和ARV的σA蛋白有很近的亲缘关系。GCRVⅡ为近几年新分离和研究的病毒，对病毒基因组各节段编码的蛋白功能还不清楚，哪些是结构蛋白，哪些是非结构蛋白也没有定论，S9基因编码的蛋白是否为结构蛋白一直还没有实验证实，也不清楚该蛋白的具体功能和免疫原性如何。

我们经实验证实，GCRVⅡ型S9基因编码的VP6蛋白为结构蛋白，能诱导免疫动物产生较高效价的特异性抗体，具有良好的免疫原性；针对VP6蛋白的抗体可以特异性识别GCRVⅡ型毒株，并对该类型毒株具有很强的中和能力；进一步试验表明，用VP6重组蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，对GCRVⅡ型VP6蛋白的研究和应用，对开发草鱼出血病新型疫苗及免疫学检测试剂盒具有极其重要的意义。

由此，本发明的一个目的在于提供一种VP6抗原蛋白，及由其制备得到的多克隆抗体。