[发明专利]一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法。

背景技术

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，全世界新诊断的结直肠癌病例数接近每年一百万。随着经济水平的升高，饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，已跃居第3～5位；死亡率位居恶性肿瘤死亡谱的第4或第5位。据预测，结直肠癌将成为我国最常见的发病率上升的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在今后很长一段时期内仍将稳步上升。Morson早在1974年提出“腺瘤—癌变”学说，认为结直肠癌的发生发展必然要经过一个腺瘤的形成过程，其演变约需10—15年。流行病学资料也显示大肠腺瘤性息肉与结直肠癌的发生呈正相关。这一连续性的病理进展需要较长的阶段，即存在较长的癌前病变期。术前无转移者根治后10年生存率可达半数以上。因此结直肠癌早期筛查和诊断非常关键。早期结直肠癌往往无明显症状，从建立的高危人群中筛查病例，使被动接受就诊者转为主动筛查是早期发现结直肠癌的有效途径，相关研究越来越受到国内外学者的重视。结直肠癌的确诊有赖于肠镜及其活检的病理诊断，但内镜属有创检查，可能带来不适和并发症，患者接受程度较低。有效的非侵袭性血液检测可能为发现结直肠癌的理因此对结直肠癌的早期诊断十分必要。

目前结直肠癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括CT扫描、核磁共振检查等。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者肠镜的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，目前在我国，尚没有普及。

目前，临床常用的监测结直肠癌的肿瘤标志物主要有癌胚抗原(CEA)、糖链蛋白19-9(CA19-9)等，用于病理学诊断结直肠癌免疫组化指标有环氧合酶-2(COX-2)、拓扑异构酶II(TOPOII)、Ki67等。CEA由Gold和Freedman从结肠腺癌中提出，为较广谱、非特异性肿瘤标记物，属于人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白。CEA已经被医学界接受并且为国际肿瘤学协会推荐，主要用于肿瘤复发的监测。CEA在95％的结直肠、胃和胰腺肿瘤以及多数的乳腺、肺和头颈部肿瘤均有升高。也有报道良性疾病的患者CEA水平升高，以及许多结直肠癌尤其在疾病早期患者CEA水平正常

近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。

CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。

采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。

目前RT-PCR方法检测结直肠癌的CTCs检测的标准还没有建立。通过检测结直肠癌患者的CTCs特征基因，能够确定结直肠癌CTCs的检测方法和检测标准。这些方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。

针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CD10、CK8、CK18、CK19 9个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。