[发明专利]一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法

说明书

本发明的目的在于提供一种高效率的无细胞蛋白质的合成方法，属于合成生物学领域。该方法将含一种或多种特定蛋白质的混合溶液加入含有大肠杆菌或其他生物体提取物的无细胞蛋白质合成反应溶液，通过加入蛋白质溶液对无细胞蛋白质合成的促进，提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。相较于对照组，本发明中EGFP蛋白质的合成量提升了1.5倍。本发明声明的特定蛋白质包括：T7 RNAP、AspRS、CysRS、IF2、IF3、EF‑G、EF‑Tu、EF‑Ts、RF2、RF3和RRF。

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及了一种无细胞系统合成蛋白质的方法。

背景描述

蛋白质的合成是几乎所有生物体内都会涉及的一种生物过程，它是开发生产抗体、疫苗和工业化酶制剂等的基础。随着限制性内切酶和PCR技术的发现，重组DNA利用微生物或植物生产蛋白质成为可能。大肠杆菌和酵母被广泛应用于应用于生产胰岛素等药用多肽。

除了利用生物体本身在体内合成蛋白质之外，衍生出了一种利用细胞提取物在体外即无细胞体系中合成蛋白的方法。无细胞蛋白合成体系利用细胞抽提物中的酶和蛋白质因子，以外源DNA或mRNA为模板，通过补充翻译所需的底物和能量物质，从而实现目标蛋白的体外合成。该方法与体内表达蛋白质的方法相比，无细胞蛋白合成有如下优势：不受胞内复杂环境的影响、可调控性强、对毒性蛋白的耐受力高、产物分离成本低。由于不需考虑细胞本身的繁殖和存活，改变诸如体系pH或离子强度相较于体内更加易行，有利于特殊蛋白质的生产。

被用于制备无细胞蛋白质合成系统所用到的细胞提取液主要有：大肠杆菌、酵母、兔网状红血球和小麦胚芽细胞等。虽然无细胞蛋白质合成系统在多肽合成的速度和准确性上达到了实验室可以接受的水平，但是一般认为基于生物体细胞提取液的无细胞蛋白质合成体系的合成速率和稳定性还不够高，离应用于实际生产蛋白质还有一定的距离。

无细胞蛋白质合成系统的最大潜在应用是代替细胞体系进行蛋白质的工业化生产，而工业化生产的必要条件是其产量和生产速率要满足可以工业化的水平。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

目前研究较多的无细胞蛋白合成体系利用细胞抽提物中的酶和蛋白质因子，以外源DNA或mRNA为模板，通过补充翻译所需的底物和能量物质，从而实现目标蛋白的体外合成。但是一般认为基于生物体细胞提取液的无细胞蛋白质合成体系的合成速率和稳定性还不够高，离应用于实际生产蛋白质还有一定的距离。

为此，本发明的一个目的在于提供一种无细胞蛋白质合成的方法。该方法通过常规的裂解大肠杆菌培养物的方法得到大肠杆菌细胞提取物，通过加入蛋白质溶液促进该无细胞蛋白质合成体系，提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种无细胞蛋白质表达体系增强剂。根据本发明的实施例，所述无细胞蛋白质表达体系增强剂含有T7 RNA聚合酶T7 RNAP或其功能等同体；天冬氨酸tRNA合酶AspRS或其功能等同体；半胱氨酸tRNA合酶CysRS或其功能等同体；起始因子2 IF2或其功能等同体；起始因子3 IF3或其功能等同体；延伸因子G EF-G或其功能等同体；延伸因子Tu EF-Tu或其功能等同体；延伸因子Ts EF-Ts或其功能等同体；释放因子2 RF2或其功能等同体；释放因子3 RF3或其功能等同体；以及核糖体循环因子RRF或其功能等同体至少之一；利用根据本发明实施例的无细胞蛋白质表达体系增强剂能够提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。

根据本发明的实施例，上述无细胞蛋白质表达体系增强剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：