[发明专利]一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法

权利要求书

1.一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使用去离子水制备浓度为1-2mmol/L的生色底物水溶液；

优选地，所述生色底物选自S2765、BAEE和BAPNA；

2)使用稀释液制备活性为0.38-0.57U/L的丝氨酸蛋白酶溶液；

优选地，所述稀释液为1mmol/L的HCl、去离子水、Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液或硼砂氯化钙缓冲液；所述丝氨酸蛋白酶选自胰酶、纤溶酶和激肽释放酶；

3)使用缓冲液制备丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品；使用缓冲液制备浓度为0.5-2.5μmol/L的供试品；

优选地，所述供试品为rPI-T1；

优选地，所述缓冲液选自pH为7.0-8.0、浓度为20-150mmol/L的Tris盐酸缓冲液，pH为7.2-7.8、浓度为20-150mmol/L的磷酸缓冲液或pH为7.0-8.0、浓度为20-50mmol/L的硼砂氯化钙缓冲液；

优选地，所述制备丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品的浓度梯度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40PIU/mL；进一步优选地为0、0.05、0.10、0.15、0.20PIU/mL；

4)在比色皿中加入步骤2)制得的丝氨酸蛋白酶溶液，然后分别加入等体积的步骤3)制得的不同的浓度梯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品，再加入步骤1)制得的生色底物水溶液，随后使用pH为7.4、浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液补充至终体积为1mL，混匀，于36-38℃孵育1-40分钟，在波长405nm处检测吸光度，每20-40秒读数一次，共检测4-10分钟；

优选地，在比色皿中加入20μL步骤2)制得的丝氨酸蛋白酶溶液，然后分别加入20μL的步骤3)制得的不同的浓度梯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品，再加入80μL步骤1)制得的生色底物水溶液；

5)以丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品的活性(PIU/ml)为横坐标，以A405对应时间(秒)的变化率为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准方程，其R≥0.99，将供试品测得的斜率带入标准方程中，计算出活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自来源于微生物、昆虫、植物或动物的丝氨酸蛋白酶抑制剂和/或重组以及突变的丝氨酸蛋白酶抑制剂；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自Kunitz或Kazal型蛋白酶超家族；

优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为蛇毒类重组胰酶或纤溶酶抑制剂；

更优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域P1氨基酸为碱性氨基酸，进一步优选地，为Arg和/或Lys。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在步骤1)中，所述生色底物为S2765；

优选地，在步骤1)中，所述生色底物水溶液的浓度为2mmol/L。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述稀释液为1mmol/L的HCl；

优选地，在步骤2)中，所述丝氨酸蛋白酶为胰酶；

优选地，在步骤2)中，所述胰酶的活性为0.47TU/ml。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述缓冲液为pH为7.4、浓度为50mmol/L的Tris盐酸缓冲液；

优选地，在步骤3)中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品纯度≥99％。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述供试品选自生产过程中产生的发酵液、微滤液、原液和制剂。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述孵育温度为37℃。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述孵育时间为2分钟。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性范围终浓度为0.05-0.4PIU/mL，更优选地为0.05-0.25PIU/mL。