[发明专利]在植物细胞内表达外源基因的核酸构建物及其应用

说明书

本发明提供了一种在植物细胞内复制或表达外源基因的核酸构建物及其应用。具体地，本发明提供了一种具有特定结构的核酸构建物，以及利用该构建物提高外源基因在植物基因组进行同源重组或定点敲入效率的方法。本发明的方法可以有效筛选同源重组或定点插入事件，从而实现外源基因片段在植物基因组的高效重组或定点插入，可以广泛应用于植物基因功能研究和作物遗传改良。本发明还提供了包含该外源构建物的载体，植物细胞和植物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种在植物细胞内表达外源基因的核酸构建物及其应用。

背景技术

在植物细胞内进行基因同源重组或定向插入一直是一个难题，为突破这个瓶颈前人已经做了大量尝试，如在2002年，Terada等人提出了基于农杆菌介导的同源重组技术(Terada et al.,2002)，这套技术体系不依赖于所改造基因的功能进行筛选，理论上可以应用于所有基因序列的打靶。然而，要保证该技术应用的成功，需要有高效的农杆菌转化效率及大规模的转化量，更重要的是，还需要附加一套复杂的正负筛选系统以消除在农杆菌转化中产生的大量随机插入事件。尽管Terada等人连续成功地把该技术应用在水稻基因定向替换实验中(Terada et al.,2002；Terada et al.,2007)，但由于极低的整合效率一直无法得以提高，加上正负筛选系统构造复杂，该技术体系并没有得到推广应用。

近年来，随着基因定向编辑工具如锌指蛋白核糖核酸酶(Zinc finger nulease，ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effectors nulease，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统的推广应用，特别是后两者由于活性高，特异性好而且几乎没有序列的限制，近两年来发展非常迅速，并且在大量物种上得到成功应用(Li etal.,2012；Sun et al.,2012；Zhang et al.,2012；Dang et al.,2013；Feng et al.,2013；Li et al.,2013；Shan et al.,2013)。上述三种基因定向编辑工具的作用机理有相通之处，通过识别序列把核酸剪切酶引导至需要编辑的基因位点上，随后的剪切作用造成DNA序列的双链断裂(double strands break，DSB)，激活了宿主细胞的DNA修复途径，通过非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)的方式，或者当同源模板在附近时，通过同源重组(homologous recombination，HR)的方式修复双链缺口。因此，利用基因定向编辑工具酶在靶位点附近制造一个DSB能在转化中极大地增加基因同源重组或定向插入的机率。

然而，相对于动物细胞和人类细胞，由于有细胞壁的阻碍，在植物细胞内进行基因重组或外源片段定点插入的一个巨大挑战就是如何把足够大量的供体分子输送到细胞中去。当然，对一些植物品种来说，例如蔬菜及一些观赏性植物，它们可以通过原生质体再生的方式重建植株(Davey et al.,2005)，这样，就可以利用原生质体作为受体，通过电转化或PEG介导的方式实现对大量细胞的转化，从而有足够的转化体对所期待的突变位点进行筛选(Zhang et al.,2012)。通过TALEN或CRISPR介导的基因打靶也已经在水稻、拟南芥、烟草等植物上得到成功(Zhang et al.,2012；Feng et al.,2013；Shan et al.,2013)，当然，这些基因打靶事件都是原生质体水平上实现的。但是对于水稻、拟南芥等植物品种，通过原生质体重建植株在目前来说几乎是不可能的，只能开发其它技术去攻克这一难关。