[发明专利]一种基于RbsB信号肽的双功能DNA元件及其应用

说明书

本发明涉及一种基于RbsB信号肽的双功能DNA元件及其应用，其序列如SEQ ID NO:1所示，或者为该序列的同义突变体，并且所述同义突变体的第16‑36位核苷酸未发生突变。本发明还涉及包括该双功能DNA元件的双启动子DNA元件和蛋白表达系统。通过在本发明的双功能DNA元件上游安置一个大肠杆菌的诱导型启动子，而在该元件下游连接需表达的外源基因序列，即可在大肠杆菌中表达外源蛋白，并可使用不同诱导条件分别将该蛋白表达在细胞质或周质空间里。该DNA构建体使研究人员能通过构建一种表达载体，而不需要分别构建细胞质和周质空间表达载体，就能比较两种表达方式的优劣。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地涉及一种基于RbsB信号肽的双功能DNA元件及其应用，以及包括该双功能DNA元件的双启动子DNA元件和蛋白表达系统。

背景技术

大肠杆菌是基因工程蛋白表达的常用菌之一。大肠杆菌具有极快的增殖速度和高效的转录、翻译能力,能够在短时间内合成大量外源蛋白。目前多数基因工程蛋白表达系统都是将外源蛋白表达在大肠杆菌的细胞质里。如果所表达的蛋白质具有良好的可溶性和稳定性，一般工程菌在几个小时内就能生产出与它们自身蛋白总量相当的外源蛋白。

虽然把外源蛋白表达在细菌的细胞质里能获得极高的产量，但这种方法也存在缺点。一个问题是外源蛋白合成后必须在细菌的伴侣蛋白协助下才能折叠成构像正确、溶解性好、具有活力的蛋白，而细胞质里的伴侣蛋白是有限的，所以一旦所表达的外源蛋白不容易折叠，而细菌又不能提供足够的伴侣蛋白进行协助时，那些折叠不正确的蛋白就会聚结在一起，在细胞质里形成不溶性的包涵体。另一个问题是细菌的细胞质是一个还原性的环境，不利于二硫键的形成，因此表达含有二硫键的外源蛋白时成功率很低。

除了细胞质，目前也有表达系统能在外源蛋白的N-端加上信号肽，将新合成的蛋白转运到大肠杆菌细胞壁和细胞膜之间的空隙里，然后折叠成具有活力的蛋白。这个空隙，称周质空间(Periplasm)，是一个氧化性较强的环境，能促进二硫键的形成，对含有二硫键的外源蛋白表达比较有利。另一方面，细菌也有限制周质空间蛋白合成速度的机制，能大幅度降低带有信号肽的外源蛋白合成，避免无法正确折叠的外源蛋白在周质空间形成不溶性的包涵体。因此，虽然周质空间表达系统所表达的蛋白水平较低，但比较容易形成正确的三维构像。

由于细胞质和周质空间表达系统各有利弊，人们在表达外源蛋白时往往都需要分别尝试，然后决定采用哪一条途径。目前这两种表达系统的质粒载体并不兼容。以MerckSigma公司(原EMD Millipore公司)的pET系列表达载体为例，其中pET23、pET28是细胞质表达载体，而pET22是周质空间表达载体。这些载体里，控制外源基因表达的都是T7启动子。将克隆有外源基因的表达载体转化到含有T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase，简称T7RNP)基因的菌株，如BL21(DE3)里，可以通过在菌液里加入IPTG诱导T7RNP的表达，从而激活载体中的T7启动子，导致外源基因的表达。这些载体的差别在于pET22载体的外源基因上游含有编码细菌pelB蛋白的信号肽序列，而pET23、pET28载体里没有。这一差别决定了所表达外源蛋白的最终定位在周质空间还是细胞质。

虽然建立一种既可以将外源蛋白表达在细胞质，也可以转运到周质空间的细菌表达载体能明显降低蛋白表达中条件优化阶段的工作量，但目前还没有成功的例子。其难度在于周质空间表达载体必须含有信号肽编码序列，而且该序列必须设计在外源基因的上游才能起作用，但这种安排也使该表达载体很难被用来表达不含有信号肽、在细胞质里积累的外源蛋白。

发明内容

发明人在研究过程中，通过突变大肠杆菌核糖结合蛋白(Ribose-bindingProtein，简称RbsB)基因的信号肽编码区域，获得了含有T7启动子的嵌合信号肽编码序列(简称T7SP)。这个特殊的T7SP序列不仅能编码具有正常功能的信号肽，同时也是T7启动子，能被T7 RNA聚合酶(T7RNP)所识别，激活下游基因的转录表达。