[发明专利]一种洪湖碘泡虫PCR特异性检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种洪湖碘泡虫PCR特异性检测引物及其检测方法。

背景技术

粘孢子虫是一类世界分布的后生动物寄生虫，可寄生于鲫鱼、两栖类、爬行类、鸟类以及哺乳类，绝大多数种类对宿主不会造成危害，但部分种类能造成非常严重的病害。异育银鲫是中国科学院水生生物研究所的鲫鱼育种专家于1976～1981年研制成功的一种鲫鱼养殖新对象，它是利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育的子代。该鱼具有良好的杂种优势，增产效果明显，且肉质细嫩，营养丰富。近年来，随着中科三号的成功培育及养殖技术的推广，其养殖规模也不断扩大，随之而来的鲫鱼病害也日趋严重。

粘孢子虫具有复杂的生活史，其宿主包括宿主鱼和水蚯蚓。研究表明，粘孢子虫在鱼体内行无性繁殖形成营养体，然后通过血液移形到靶器官发育成熟形成包囊(成熟孢子)；孢子成熟后脱落或随着鱼体死亡、鲫鱼粪便、尿液落入水柱中并沉淀到底部，进而被土壤中的水蚯蚓吞食，孢子被水蚯蚓摄入后在其体内行有性生殖发育、移形并以放射孢子虫的形式释放到水柱中，水柱中的放射孢子虫又通过皮肤、鳃等感染鲫鱼宿主并在体内发育进行下一个生活史。

洪湖碘泡虫是异育银鲫“喉孢子虫病”病原体，主要感染鲫鱼鱼种，但近年来在鱼苗也有发现，主要寄生在鲫鱼喉部，严重寄生时会导致鲫鱼喉部严重充血，剪开喉部会发现里面充满了大量豆腐渣样包囊，有时也会直接撑破喉部导致鲫鱼死亡。然而，当鲫鱼喉部出现明显病症，镜检可发现成熟孢子时已处于发病末期，主要是由于粘孢子虫成熟后在孢子外形成坚硬的几丁质壳，一般的药物无法穿透，因此无法杀死该虫。但当孢子在鱼体内处于营养体以及在水 体中处于放射孢子虫阶段时，普通的药物都可以轻易将它杀死，从而达到预防的目的。另一方面，土壤中孢子丰度对我们评估洪湖碘泡虫的爆发有积极指导作用。因此，发展洪湖碘泡虫特异性检测方法检测鱼体内处于营养期的孢子、水体中放射孢子虫以及土壤中孢子丰度尤为必要。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性强、灵敏度高、快速检测的洪湖碘泡虫PCR特异性检测引物及其检测方法。

一种洪湖碘泡虫PCR特异性检测引物，包括正向引物和反向引物；

正向引物MHF：5’-TAAAGTTAGCATCGAGAGCA-3’；

反向引物MHR：5’-CGCTGTATGATTAAACTGCT-3’。

一种洪湖碘泡虫的PCR特异性检测方法，包括以下步骤：以洪湖碘泡虫的ITS基因为靶基因，通过PCR方法，以待检样品为模板，以上述特异性检测引物扩增靶基因，经琼脂糖电泳后检测是否会产生432bp大小的特异性电泳条带，从而将洪湖碘泡虫成分进行特异性鉴定。

在其中一个实施例中，PCR方法的反应体系为：10×PCR BuFFer 2.5μL，2.5mmol/L的dNTP Mixture 2.0μL，5U/μl Takara Taq 0.3μL，10μmol/L MHF 0.5μL，10μmol/L MHR 0.5μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水补足至体积25μL。

在其中一个实施例中，所述PCR方法的反应参数如表1所示：

表1

上述洪湖碘泡虫PCR特异性检测引物，设计合理，用于洪湖碘泡虫检测，不仅能成功从鲫鱼喉部组织、血液中检测洪湖碘泡虫，也能从水样、土壤中检测洪湖碘泡虫，具有较高的特异性与灵敏性，操作简便，快速准确，同时还可以监测洪湖碘泡虫在水域生态系统中的整个生活史过程，可直接应用于生产实 践中，对减轻洪湖碘泡虫对我国异育银鲫养殖业造成的损失有积极的作用。

附图说明

图1为本发明的洪湖碘泡虫PCR引物特异性检测图，其中，1：双蒸水空白对照；2：洪湖碘泡虫；3：鲫鱼肌肉组织；4：瓶囊碘泡虫；5：吴李碘泡虫；6：塔形碘泡虫；7：射阳碘泡虫；8：倪李碘泡虫；9：丑陋圆形碘泡虫；10：口腔碘泡虫；11：普罗尼碘泡虫；12:荆州碘泡虫；13：多涅茨尾孢虫；14：水滴尾孢虫；15：DL2000Marker；

图2为鲫鱼喉部组织样品中洪湖碘泡虫PCR特异性检测图，图中，1：孢子添加个数为7.0x10⁴；2：孢子添加个数为7.0x10³；3：孢子添加个数为7.0x10²；4：孢子添加个数为7.0x10¹；5：孢子添加个数为7.0x10⁰；M：DL2000Marker；