[发明专利]一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法，所述油乳剂蛋白亚单位疫苗包括一种抗原蛋白和油佐剂，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)准备标准蛋白；

(2)使用苄醇从疫苗中分离出水相；其中，所述使用苄醇从疫苗中分离出水相包括以下步骤：1)取9ml疫苗于15ml离心管中，加入1ml苄醇，振荡混匀，进行破乳；2)然后3,000rpm/min，4℃，离心15min，加速破乳；3)离心后得三相，中间相为水相，体积为4ml±0.1ml，用5ml注射器小心吸取中间水相，再使用0.22μm滤膜过滤水相，所得水相储存于1ml EP管中，备用；

(3)使用HPLC检测步骤(1)中准备的标准蛋白和步骤(2)中分离出来的水相中的抗原蛋白；其中，色谱柱：凝胶过滤色谱柱；流动相：20mM磷酸盐，200mM Nacl，PH6.8；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；进样体积：50μl；单波长280nm采样；采样速率2点/秒；

(4)以标准蛋白的浓度为纵坐标，以步骤(3)中检测出来标准蛋白对应的峰面积为横坐标建立标准曲线，由此得到标准曲线的函数及R²，其中R²必须大于0.99；

(5)将步骤(3)中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积作为步骤(4)中函数的x代入函数中计算得到y值，此y值即为水相中目的蛋白的浓度；

(6)以步骤(5)中水相中目的蛋白的浓度×苄醇分离疫苗时所得水相的总体积÷所取疫苗的总体积，计算得到疫苗中抗原蛋白的浓度；

(7)根据步骤(3)中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积占所有峰面积的比例，确定疫苗中抗原蛋白的纯度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗原蛋白分子量不低于80kDa。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述油佐剂为水包油佐剂或水包油包水佐剂。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述油佐剂为ISA 201 VG或白油。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准蛋白为标定好浓度的疫苗中的抗原蛋白，所述标准蛋白的浓度梯度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的苄醇分离疫苗时所得水相的总体积为4ml±0.1ml。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的所取疫苗的总体积为9ml。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述准备标准蛋白包括以下步骤：根据BCA法蛋白含量测定的浓度，将标准蛋白进行倍比稀释，浓度梯度为：400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，1ml/管，都用0.22μm滤膜过滤，备用。

9.使用如权利要求1-8任一所述的检测方法在油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原含量和纯度的检测中的应用。