[发明专利]利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法

权利要求书

1.利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，其特征在于包括以玉米异源六倍体为母本，以玉米为父本杂交，收获结实籽粒，得F₁代；然后对F₁代的染色体组成进行鉴定，选择染色体总数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株；再以所选的植株为母本，以玉米为父本回交，获得BC₁代；对BC₁代进行染色体组成进行鉴定，然后选择染色体总数为21～39条、且大刍草染色体数为1～5条的后代为母本，以玉米为父本继续回交，得BC₂代；选择BC₂代中染色体总数为21，其中玉米染色体为20条、大刍草染色体数为1条的材料，即为玉米-大刍草单体附加系；其中所述的玉米异源六倍体是指MTF-1或其衍生系；所述的衍生系是指以MTF-1为母本，以玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代，所得的新的异源六倍体。

2.利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，其特征在于其具体步骤如下：

（1）、从三月下旬开始，分10批种植玉米，每批20株，每批间隔3天；四月上旬将玉米异源六倍体种植于花盆内；

（2）、在吐丝前将玉米异源六倍体雌穗套袋，并在授粉前将其花丝剪短至2～3cm，然后以玉米为父本给玉米异源六倍体雌穗授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后都在套袋上作标记，成熟时收获种子，获得F₁代；

（3）、次年4月，将步骤（2）所得的F₁代种子种植在人工气候箱的营养钵中，在28℃、湿度为70%的条件下催芽，植株生长至2叶1心时移栽至花盆中种植；待植株株高≥30cm时，在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，采用染色体压片技术鉴定体细胞染色体数目，利用原位杂交技术鉴定染色体组成，每个单株至少统计50个细胞；选择染色体数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株做母本，在雌穗吐丝前套袋，吐丝后剪短花丝至1～2cm，以玉米为父本进行授粉，在第1次授粉后隔2天重复授粉1次，每个雌穗至少重复授粉3次，成熟时收获种子，得BC₁代；其中所述的玉米与步骤（1）一样进行分期种植；

（4）、按照步骤（3）中所述的方法种植所得的BC₁代，并按照步骤（3）中所述的方法采用染色体压片和原位杂交技术对BC₁代根尖染色体数目和组成进行鉴定；选择BC₁代中染色体总数为21～39条且大刍草染色体数为1～5条的植株；用玉米作为父本给所选的BC₁代植株授粉，收获得BC₂代；

（5）、按照步骤（3）中所述的方法种植BC₂代，采用染色体压片技术对根尖染色体数目进行鉴定，BC₂代材料染色体总数只有20条和21条的两种类型；

（6）、利用火焰干燥法对步骤（5）中染色体数目为21条的植株剩余根尖进行染色体制片，选择染色体处于中期且分散度较高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生物素标记玉米和大刍草总基因组DNA，鉴定染色体组成；选择根尖细胞染色体数目为21条，且其中含有20条玉米染色体和1条大刍草染色体的材料，即为玉米-大刍草单体附加系；

所述的玉米异源六倍体均指MTF-1或其衍生系；

所述的衍生系均指以MTF-1为母本，以玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代，所得的新的异源六倍体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的玉米是指普通栽培玉米，所述的玉米是杂交种、自交系、地方品种或综合种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其步骤（3）中所述的染色体数为45~50条；所述的大刍草染色体数为1~10条。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其步骤（3）、（4）或（5）中所述的染色体压片的方法为：在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，并用α-溴萘饱和水溶液预处理3 h，将预处理后的根尖在室温下用双蒸水低渗30min，然后用甲醇和冰乙酸以体积比为3：1的比例配制的新鲜固定液固定12h以上，再将固定后的根尖置于70%无水乙醇中，保存在4℃中过夜，用双蒸水洗净根尖上的固定液，用等量混合的6%纤维素酶与1%果胶酶，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡宝品红染色进行压片，显微照相并统计染色体数目。