[发明专利]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

HP-PRRSV-F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；

HP-PRRSV-R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；

HP-PRRSV-P2：FAM-AACTGTGACAACAACGCTGACGCA-BHQ1；

以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

CSFV-F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；

CSFV-R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；

CSFV-P1：HEX-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ1。

2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒同时检测试剂盒或检测试剂中的应用。

3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法RT-ddPCR探针法预混液，探针法RT-ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒基因组RNA的提取液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法RT-ddPCR探针法预混液中引物探针浓度均为10μM，引物单体系加1.8μL，反应终浓度为900nM，探针单体系加0.5μL，反应终浓度为250nM。

8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：

(1)配制RT-ddPCR反应液；RT-ddPCR反应液20μl配方为：一步法RT-ddPCR探针法预混液18μL，待测样品RNA模板为2μL；

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中PCR的扩增程序为48℃反转录20min；95℃预变性10min；94℃变性10sec，56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设为2.5℃/sec，结束反应。

10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用。