[发明专利]一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用，所述重组共表达载体以质粒pET‑28b、质粒pETDuet‑1或质粒pCDFDuet‑1为基础，包含核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因和核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因。本发明方法在双酶分开单独表达后组合催化方法的最大底物投料量50g/L(已在专利申请(201610124451.5)中公开)的基础上进一步提高到60g/L以上，同时双酶共表达体系有利于全细胞固定化，更具工业化应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌，并使用醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化合成阿托伐他汀钙双手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

(二)背景技术

心血管疾病是当今对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过肿瘤性疾病而跃居第一。血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平上升是诱发心血管疾病的一个重要因素，3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的关键限速酶。阿托伐他汀钙能竞争性抑制胆固醇合成的关键限速酶—HMG-CoA还原酶活性，减少胆固醇的合成，控制体内LDL-C浓度，是临床上广泛使用的降血脂药。

各国药监部门对手性药物的光学纯度设置了严苛的限制(e.e.值99.5％，d.e.值99％)。阿托伐他汀钙是重大手性药物品种，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙合成的关键手性合成前体，开发绿色、低生产成本6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成工艺意义重大。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成法存在诸多缺陷：安全性差；环境不友好；双手性合成控制复杂，产物手性纯度低；产物收率低，生产成本高。生物催化具有反应条件温和、选择性高等优势，因此，开发6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成技术具有重要的研究意义及社会经济效益。

利用醛酮还原酶不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯往往需要偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系。常见的醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶分开表达后再协同催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺细胞培养批次多，在不同的细胞内进行辅酶氧化和还原需要多次跨膜转运，这增加了传质阻力。构建醛酮还原酶基因-葡萄糖脱氢酶双酶共表达体系，利用醛酮还原酶基因-葡萄糖脱氢酶双酶共表达菌体催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯能够减少一半的细胞培养批次，且辅酶的氧化和再生在同一个宿主细胞内进行，这提高了反应效率，增加过程的经济性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种活性高、立体选择性好的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达体重组菌，开发其在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯上的应用。其中醛酮还原酶来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)及其突变体，葡萄糖脱氢酶来自西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶基因重组共表达载体，所述重组共表达载体以质粒pET-28b、质粒pETDuet-1或质粒pCDFDuet-1为基础，包含核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因和核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因。

本发明所述的重组表达载体可以通过本领域常规方法将本发明的突变醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可以为本领域常规的各种载体，如pETDuet-1，pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pCOLADuet-1、pGEX(all)、pMAL(all)等，所述质粒仅代表部分质粒。本发明所述重组载体优选pET-28b、pETDuet-1、pCDFDuet-1质粒。