[发明专利]一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；

S2、裂解细胞并收集裂解液；

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析；

步骤S1包括如下具体步骤：通过Bac-to-Bac系统构建包含血凝素基因全长片段的重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后离心收集沉淀；

步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为：利用RT-PCR技术扩增流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段；将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中，并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞，使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组rBacmid；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒种毒；

步骤S2具体包括如下步骤：用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀，200rpm搅拌30min，将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，2％Triton X-100，5％甘油，pH 5.9；

步骤S3具体包括如下步骤：

S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后，将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来；

S32、裂解液上柱：将裂解液以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，上样体积不超过10个柱体积；

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，之后将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱分离；

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过阳离子交换层析柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白；其中，所述阴离子交换层析柱为Macro-Prep Q，所述阳离子交换层析柱为Macro-Prep High S；

其中，步骤S33还包含用5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过分离后阳离子交换层析柱的步骤；

所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，0.01％Triton X-100，5％甘油，pH 5.9；所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03；所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，10～100mM NaCl，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03；

所述流感病毒为甲型流感病毒。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱的再生方法为：首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱，流速控制为5ml/min；所述再生缓冲液配方为：0.5M NaOH，1M NaCl。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包含S4浓缩步骤，将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。