[发明专利]卡泊芬净发酵中间体的发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及抗真菌药物的微生物发酵，具体涉及纽莫康定B0的微生物发酵方法。

背景技术

棘白菌素化合物发现于20世纪70年代，是一类具有六元环肽和不同脂肪酸侧链的微生物次级代谢产物，能够特异性地作用于真菌细胞壁，非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，从而能够起到抗菌效果，且不对人体产生影响。纽莫康定B₀的半合成衍生物卡泊芬净是首个被报道的棘白菌素类化合物，2001年被美国FDA批准用于曲霉菌感染的治疗。目前，卡泊芬净已成为全身用抗真菌药市场的王牌药物。

纽莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis发酵合成的次级代谢产物。

纽莫康定B0 Cas：135575-42-7

Glarea lozoyensis的发酵产物主要有A0和B0两种有效产物，除此之外，发酵过程中也会多种环状六肽的结构类似物，其中C0的结构和B0最为接近，两者的结构差异在于B0中的反式3-羟基脯氨酸，在C0中是反式4-羟基脯氨酸。在实际生产中，主要采用的是树脂柱工艺对纽莫康定B0进行提纯，柱层析应用于工业化生产时，费时，溶剂使用量大，易造成环境污染，且原料损耗大，使得生产成本大幅提高，C0是纽莫康定B0的异构体，在结构上的差异表现为一个羟基位置的不同；C0杂质不能在反相色谱中与纽莫康定B0分离，只有通过正相色谱分离。发酵液中的C0杂质一般10％，如果不能得到有效的控制，最后得到的是纽莫康定B0和C0的混合物。C0杂质能参与后续反应，严重影响醋酸卡泊芬净的质量。

纽莫康定C0 Cas：144074-96-4

发酵过程中结构类似物的有效控制，能提高后期的分离效率，降低生产成本，因此如何提高B0效价同时降低副产物的比例，是研究人员关注的方向。

发明内容

本发明提供一种新的纽莫康定B0的发酵方法，该方法在提高纽莫康定B0发酵单位的同时，还能降低发酵液中纽莫康定C0的含量，在该方法中使用的菌种为Glarea lozoyensis，所述发酵条件如下：

发酵培养基(wt)：乳糖3.0％，苏氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH₂PO₄0.15％，七水合硫酸镁0.05％，MES缓冲盐1.5％，pH 5.3。

发酵过程中温度24～26℃，起始通气量0.5～1.0VVM，罐压0.04～0.06Mpa。发酵过程中逐渐调高通气量与转速使溶氧不低于20％，转速最大600转，通气量最大1.2VVM。

发酵24h后，开始流加氨水，控制pH5.0～5.4。

发酵48h后，开始补加维生素b5，按照培养基的体积，添加量为20～40mg/l。

发酵60h后，开始流加乳糖，流加速度为1.5～2.5％/天(质量体积比)，使发酵液总糖浓度控制在1～3％之间，直到发酵结束。

发酵72h后(通气量与转速已调至上限)，根据溶氧量变化调节pH控制范围，直到发酵结束：溶氧量不低于45％时，控制pH5.0～5.4；溶氧量为35％～45％时，控制pH5.4～5.8；溶氧量为25％～35％时，控制pH5.8～6.2；溶氧量低于25％时，控制pH6.2～6.6。

发酵培养期共10天，10天后放罐。

本发明培养基采用稀配方，发酵过程中流加乳糖和氨水，能够有效降低菌体粘度，提高通气效果，同时在发酵过程中严格控制pH。

流加乳糖后，发酵液总糖浓度控制在1～3％之间，在这个范围内菌丝的正常生长代谢是稳定的，过低则影响正常代谢，过高则不利于下一步的放罐提取。

且该方法在发酵液中补加维生素b5，使得纽莫康定C0的含量可由原来的约6％降至1.5％。

现有纽莫康定B0的发酵技术中，纽莫康定B0的发酵单位约为800～1000mg/l，本发明发酵方法可将发酵单位提高至2000～2500mg/l，且纽莫康定C0的含量大幅下降。

具体实施例

实施例1

发酵菌种：Glarea lozoyensis

发酵培养基(wt)：乳糖3.0％，苏氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH₂PO₄0.15％，七水合硫酸镁0.05％，MES缓冲盐1.5％，pH 5.3。

50L发酵罐培养，培养基30L，121℃消毒30分钟。种量1.5L，发酵液培养温度25℃，起始通气量0.9VVM，200转，罐压0.05Mpa，发酵过程中逐渐调高通气量与转速使溶氧不低于20，转速最大600转，通气量最大1.2VVM。发酵24h后，开始流加氨水，控制pH5.0～5.4。发酵48h后，开始补加维生素b5，添加量为30mg/l。发酵60h后，开始流加乳糖，流加速度为2.0％/天(质量体积比)，使发酵液总糖浓度控制在1～3％之间，直到发酵结束。发酵72h后(此时通气量与转速已调至上限)，根据溶氧变化调节pH控制范围，直到发酵结束：溶氧量不低于45％时，控制pH5.0～5.4，96h溶氧量为35％～45％，控制pH5.4～5.8，110h溶氧量为25％～35％，控制pH5.8～6.2，130h溶氧低于25％，控制pH6.2～6.6，144h溶氧回升至25％，控制pH5.8～6.2，168h溶氧回升至35％，并维持在35％～45％之间，控制pH5.4～5.8，240h发酵结束，放罐，测定纽莫康定B0的发酵单位为2345mg/l，纽莫康定C0的含量为1.5％。