[发明专利]一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒

说明书

本发明提供的一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，其包括：(1)鱼样品取样及鱼体表微生物固定处理；(2)肠道微生物的获取及菌体的收集；(3)细胞的包埋与裂解；(4)DNA的提取；(5)DNA保存。试剂盒主要成分：溶液A：为Tris、EDTA的混合溶液；B为Tris、EDTA、NaCl、PVP、异硫氰酸胍、Triton‑X100、PMSF、β‑巯基乙醇的混合溶液；C为Tris、EDTA、NaCl和DTT的混合溶液；溶液D为蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液；E为Tris饱和酚和氯仿混合液；F为异丙醇；G为乙醇水溶液。本发明得到的DNA片段纯度高，宿主及宿主体表微生物DNA含量少。

技术领域

本发明涉及DAN提取领域，尤其涉及一种鱼肠道微生物宏基因组文库构建总DNA的提取方法及试剂盒。

背景技术

目前传统的微生物研究手段只能培养0.1％～1％的环境微生物，这将无法整体分析和利用微生物群落的构成和功能。宏基因组文库技术可以避开对微生物纯培养的限制，直接从环境中获得DNA分子，通过测序或者文库筛选，为人类进一步利用微生物资源提供了重要手段。DNA的提取与纯化是宏基因组文库构建的第一步，也是最关键的一步。

鱼肠道微生物具有非常重要的研究价值，可以用于研究鱼类健康和营养代谢、获得新型酶制剂等。常规DNA提取主要参照粪便DNA提取法。但是由于在文库构建过程中获得高纯度和高质量的DNA，应尽量避免鱼类体表微生物、鱼类肠道组织和食物的污染，同时还要避免鱼类消化道消化液对DNA的降解。因而，常规DNA提取方法满足不了鱼肠道微生物宏基因组文库构建的要求。所以，现有技术有待于更进一步的改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供的一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，在节约成本的前提下，提取高纯度DNA。

为解决上述技术问题，本发明方案包括：

一种用于鱼肠道微生物宏基因组总DNA提取方法的试剂盒，其包括：

溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；

溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L异硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巯基乙醇，pH 8.5；

溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；

溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；

溶液E：50％Tris-HCl饱和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％异戊醇；

溶液F：96％氯仿,4％异戊醇；

溶液G：异丙醇；

溶液H：70％乙醇。

使用所述试剂盒之鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法，其包括以下步骤：

步骤一，将新鲜的样品鱼击昏，用吸水纸吸干样品鱼体表液体，用75％的酒精擦拭样品鱼体表面，置于-20℃冰箱内进行冷冻15-30分钟；

步骤二，使用溶液A配制琼脂糖凝胶溶液，在保温箱内使其平衡到65℃；

步骤三，迅速取出上述步骤一得到的样品鱼，使用步骤二得到的琼脂糖凝胶溶液涂渍样品鱼体表，对样品鱼体表微生物进行固定；冷却后使用灭菌手术剪迅速对鱼体进行解剖，分离得到鱼肠道；