[发明专利]一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法

权利要求书

1.一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：采用羟基脲和N₂O双阻断法诱导石刁柏细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞，再经低渗、固定和制片步骤大量获得形态清晰、分散良好且适用于后续细胞学研究的染色体玻片标本。

2.根据权利要求1所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）根尖培养：将石刁柏种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.8-1.5cm；

（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为2.5mmol/L的羟基脲处理根长为0.8-1.5cm的石刁柏种子18h；

（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖4-6h；

（4）N₂O预处理：切取根尖放入N₂O气室中处理1-3h；

（5）低渗：用摩尔浓度为0.075mol/L的KCl溶液处理30-90min；

（6）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min；

（7）滴片：固定后用去离子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生组织区，置于质量分数为1%的果胶酶和质量分数为2%的纤维素酶的混合液中，37℃酶解2h，酶解完成后加入TE缓冲液反复吹打以去除根冠和根尖外层组织，然后用体积分数为70%的乙醇洗根尖两次，在40μL乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μL无水乙酸，混匀后吸5-8μL滴片，室温放置5min后即可镜检。

3.根据权利要求2所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：步骤（1）中石刁柏根长优选为1cm。

4.根据权利要求2所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：步骤（3）中清水培养根尖的时间优选为5h。

5.根据权利要求2所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：步骤（4）中N₂O的处理压强为1.01MPa，N₂O的处理时间优选为2h。

6.根据权利要求2所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：步骤（5）中KCl溶液的处理时间优选为60min。