[发明专利]非糖基化蛋白质的纯化

说明书

本申请是申请日为2009年1月15日、发明名称为“非糖基化蛋白质的纯化”的中国专利申请200980102331.3(国际申请号PCT/EP2009/000192)的分案申请。

发明领域

本发明涉及多肽纯化的领域。报道了利用三个层析步骤的组合纯化非糖基化多肽的一般方法。

发明背景

蛋白质在今天的医药领域中起重要作用。对于人类应用，每一药学物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人类的安全性，必须特异性地去除可能引起严重危害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为了满足管理规定，制造方法后必须进行一个或更多纯化步骤。其中，纯度、通量和产量在决定适当的纯化方法中起重要作用。

很好地建立了不同方法，并且所述方法广泛用于蛋白质纯化，如使用亲硫配体、Cu-螯合物或微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换层析、阴离子交换层析和混合模式层析)、亲硫吸附、疏水相互作用或芳香族吸附层析、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

例如可通过原核细胞如大肠杆菌(E.coli.)产生重组多肽。重组产生的多肽占原核细胞多肽含量的大多数并且在原核细胞中经常沉积为不可溶的聚集物，即沉积为所谓的包含体。为了分离重组多肽，必须崩解细胞并从细胞碎片中分离所述包含体后将该包含体中所含的重组多肽溶解。对于增溶离液剂，使用如尿素或盐酸胍。尤其是在碱性条件下，为了切割二硫键，加入还原剂，如二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。在将聚集的多肽溶解后，必须重新建立生物活性必需的重组多肽的球形结构。在这个所谓的复性过程中，例如通过针对合适的缓冲液进行透析来缓慢降低变性剂的浓度，其允许变性的多肽重新折叠成生物活性结构。复性后是重组多肽纯化到预期使用的可接受纯度。例如，为了用作治疗蛋白，必须建立高于90％的纯度。从大肠杆菌中获得的重组产生的多肽一般伴随有核酸、内毒素、来自生产细胞的多肽和非复性的重组多肽。

在可获得许多不同层析方法的情况下，必须测试许多组合以寻找合适的纯化方法。在这些组合中，可使用不用的顺序，甚至不同数量的层析方法。因此，期望拥有确定层析步骤的合适顺序用以纯化非糖基化的多肽的方法。

在WO 2007/075283中报道了靶分子纯化的多步骤系统和方法。在WO 2007/016250中报道了用于纯化包含目的蛋白的化合物的方法。在WO 2006/101441中报道了仅包括一个或很少程序步骤的纯化重组蛋白的方法。Rege等(Rege,K.,Biotechnol.Bioeng.93(2006)618-630)报道了用于重组蛋白质纯化的高通量方法开发。在KR 2002/080108中报道了用于从重组大肠杆菌中纯化人生长激素的方法。

发明概述

本发明的第一个方面是用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其中所述方法包括以下顺序的以下三个层析步骤：

a)选自以下的第一个层析步骤

i)疏水电荷诱导层析,

ii)疏水作用层析,

iii)亲和层析，或

iv)离子交换层析，

b)选自以下的第二个层析步骤

i)阴离子交换层析,

ii)阳离子交换层析,

iii)羟基磷灰石层析,

iv)疏水作用层析，或

v)疏水电荷诱导层析,

c)选自以下的第三个层析步骤

i)疏水电荷诱导层析,

ii)阴离子交换层析,

iii)阳离子交换层析，或

iv)疏水作用层析,

由此，

-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，第一个层析步骤是亲和层析，

-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，

-在多肽具有低或高等电点的情况下可以以流通模式进行第三个层析步骤，

-任选地第三个层析步骤可用于多肽的浓缩，

并在步骤c)后获得纯化的非糖基化异源多肽。

本发明的方法包括至少三个层析步骤，由此对于每一步骤，可不依赖于为前述步骤或以下步骤所选的层析材料选择层析材料，由此仅需要考虑所给出的条件。因此，本发明的方法提供了用于纯化非糖基化多肽的灵活的和可交换顺序的层析步骤，由此在非糖基化多肽经历本发明方法后获得的纯度同样独立于所选层析步骤顺序。