[发明专利]均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法

说明书

技术领域

本发明涉及EGFR等位基因19外显子突变指数检测技术领域，具体涉及一种均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法。

背景技术

等位基因变异是细胞中一对同源染色体双链DNA相同位置上控制某性状基因的变异。个体基因组中，等位基因变异与野生型同时存在，相互制约平衡，共同影响基因表达和功能，影响生物反应，决定细胞转归性质等表型；个体内等位基因变异存在异质性和剂量效应，不同个体在不同阶段等位基因变异与野生型的相对数量水平不同，变异相对数量水平变化直接影响基因功能和表达。EGFR等位基因19外显子变异与野生型同时存在，互相影响，共同决定细胞EGFR靶向药物反应性表型。不同个体EGFR等位基因19外显子E746-A750的缺失突变含量差异较大，我们将基因组中EGFR等位基因19外显子变异型与野生型的比例即相对数量水平命名为EGFR等位基因19外显子突变指数，它是个体较EGFR等位基因19外显子变异型别和绝对数量与药物反应性更高度相关、更敏感特异、更科学准确、标准量化的的分子标识。故个体中EGFR等位基因19外显子野生型与突变型相对含量：EGFR等位基因19外显子突变指数是更全面的EGFR靶向药药效预测指标。但目前现有技术或只检测EGFR等位基因19外显子突变或只检测其绝对量，而未检测EGFR等位基因19外显子野生型与突变型的相对含量比例，因检测对象片面，检测结果受取材基因变异异质性、取材方法、数量部位等因素影响，应用价值低；或检测方法繁琐低效、不标准化。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光偏振均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，用于EGFR等位基因19外显子突变指数即EGFR等位基因19外显子野生型与突变型含量比值的检测，克服现有技术存在的片面、成本高、操作步骤繁琐、易污染的问题。

本发明所采用的技术方案为：

均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

所用试剂包括：

MgCl₂，10×PCR反应缓冲液，dNTPs，EGFR等位基因19外显子DNA引物，EGFR等位基因19外显子E746-A750，2236到2250位碱基的15bp缺失突变DNA的FAM标记探针、EGFR等位基因19外显子E746-A750，2236到2250位碱基的15bp野生型DNA的R110标记探针，模板：待检测样品DNA，阴性对照标准品即pGEM-T-easy空载体、阳性对照标准品即EGFR等位基因19外显子野生型对照标准品与19外显子突变型对照标准品的混合物，浓度均为1000拷贝/ml；

对试剂分别进行扩增，然后对扩增产物分别进行FAM和R110荧光偏振值的检测，阳性对照标准品FAM和R110荧光偏振值分别大于阴性对照标准品FAM和R110荧光偏振值30mp以上则为扩增成功，根据待检测样品FAM和R110荧光偏振值与阳、阴性对照标准品的差值高低变化和比值判读待检测样品的EGFR等位基因19外显子突变指数。

扩增反应在25uL体系中进行，加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度均为2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，DNA聚合酶1-2单位，浓度为1.5-3.0mM MgCL₂。浓度均为0.5uM的EGFR基因19外显子上游引物和3’端带荧光标记的2种探针,浓度0.1uM-0.05uM的EGFR等位基因19外显子下游引物；5μL模板DNA；

PCR缓冲液是1.0U Taq polymerase。

据EGFR等位基因GenBank序列，设计合成覆含EGFR等位基因19外显子E746-A750的引物及19外显子野生型、突变型探针：

EGFR19正向引物5'-gtgcatcgctggtaacatcc-3'；

EGFR19反向引物5'-gaagcaacatctccgaaaagc-3'；

19外显子野生型探针：5’-gagggaattaagagaagctc–R110 3’；

19外显子突变型探针：5’-gccaaaacatctccggc-FAM 3’。

扩增反应条件为：94℃变性5min后，95℃孵育1秒，60℃孵育1秒，72℃孵育10秒，45个循环，最后一个循环无72℃孵育。