[发明专利]一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将来自于苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶基因ido和来自于透明颤菌的血红蛋白基因vgb共表达，构建谷氨酸棒杆菌表达载体pJYW‑4‑ido‑vgb；将该表达载体电转入产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01中，获得了重组谷氨酸棒杆菌SN01/pJYW‑4‑ido‑vgb。该重组菌在以L‑异亮氨酸为底物生产4‑羟基异亮氨酸(4‑HIL)的过程上，可解除L‑异亮氨酸对IDO的底物抑制，使得4‑HIL发酵产量提高了50.0％。

技术领域

本发明涉及一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

据世界卫生组织报道，糖尿病、癌症、心血管疾病和呼吸系统疾病是四大慢性非传染性疾病。自1980年以来，患糖尿病的成年人数目增长了四倍，已达到4.22亿。目前研究表明，葫芦巴种子可用于临床治疗二型糖尿病，而在葫芦巴种子中起关键作用的物质就是(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)。4-HIL是一种非蛋白质氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，因此4-HIL在治疗二型糖尿病方面有良好的应用前景。但是目前4-HIL的产量还很低，难以满足市场需求。4-HIL的制备方法主要有：葫芦巴种子提取法、化学-酶合成法、酶合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是生产4-HIL最简单、有效和经济的方法。

葫芦巴种子是目前所知的4-HIL含量最为丰富的天然生物材料。自1973年以来，人们不断尝试并改进葫芦巴种子的4-HIL分离提取方法，虽然目前用这种方法实现了4-HIL的生产，但是却存在着材料受限、工艺复杂、分离成本高、得率低和纯度较低等问题，总收率都不足1％，这使得4-HIL的产量很低，价格异常昂贵。化学-酶合成法则需要八步或者六步化学-酶反应，才能合成出4-HIL，不仅工艺复杂、步骤繁琐，而且分离成本较高、得率较低且纯度较低，致使这类方法没有进展下去。2007年研究者又发现了4-HIL的两步酶合成法，但是由于4-HIL产率低、副产物含量高而使得相关研究没有深入下去。最近，苏云金芽孢杆菌异亮氨酸双加氧酶(IDO)的发现使得4-HIL的生物合成成为可能。

IDO催化L-异亮氨酸发生4-羟化反应，生成4-HIL，同时使α-酮戊二酸发生氧化反应，生成琥珀酸，这个反应需要消耗氧气并生成二氧化碳(图1)。通过在大肠杆菌中克隆表达IDO编码基因ido，就可以将外源添加的L-异亮氨酸转化成4-HIL。但是由于大肠杆菌本身并不积累L-异亮氨酸，因此在这个微生物发酵体系中需要外源添加L-异亮氨酸，这无疑会增加4-HIL的生产成本。谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum)SN01是一株L-异亮氨酸生产菌，在这株菌中克隆、表达ido基因后，可以将其自身积累的L-异亮氨酸转化成4-HIL，从而实现4-HIL的一步从头合成，无需添加L-异亮氨酸等前体物质，具有明显的技术优势。然而，在利用重组表达了异亮氨酸双加氧酶的谷氨酸棒杆菌生产4-HIL时，尽管L-异亮氨酸是4-HIL的直接底物，但在L-异亮氨酸达到一定浓度后，提高L-异亮氨酸的供应量却会导致4-HIL产量降低，从而使得4-HIL的产量无法预期，造成4-HIL生产的技术困难。具体表现为，当L-异亮氨酸的浓度比较低时，IDO的活性会随着底物L-异亮氨酸浓度的提高而提高，但是当L-异亮氨酸的浓度超过20mM以后，IDO的活性却又受到L-异亮氨酸底物的抑制，且L-异亮氨酸浓度越高，抑制程度越强。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株共表达异亮氨酸双加氧酶基因和透明颤菌血红蛋白基因的重组谷氨酸棒杆菌，用于催化L-异亮氨酸生成4-HIL，并解除底物L-异亮氨酸对双加氧酶的底物抑制，进而提高发酵法生产4-HIL的产量。