[发明专利]一种mRNA分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法

说明书

本发明公开了一种mRNA分子在植物砧穗间传递的分子鉴定方法，涉及植物分子生物学领域。本发明构建基因携带荧光蛋白标签的载体进行转基因，将转基因砧木和野生型接穗在无菌玻璃瓶中进行微嫁接，由于接穗存在在潮湿的环境中易长出不定根的特性，通过激光共聚焦显微镜检测接穗不定根发出的荧光的有无，来判断基因是否发生了砧穗间远距离传递；或者通过巢氏PCR验证砧穗是否都出现特异性条带来判断基因是否发生了砧穗间远距离传递，最终实现了可直观观测基因在砧木和接穗间进行远距离传递的目的，本发明方法具有直观、快速、灵敏、准确性高，能够应用于各种植物基因而不受物种限制，在植物分子生物学领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是一种mRNA分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法。

背景技术

在园艺作物生产实践过程中，应用嫁接技术可以提高植株抗性、增加产量、改善果实品质，对品种的改良，经济价值的提高都有着非常重要的意义，其中在果树生产上嫁接更是得到了广泛运用。在果树生产上发现，不同砧木对接穗的生理生化特性、开花结实、环境的适应能力以及树体生长发育等方面能产生不同的影响，而这些影响最终会对果品的形成以及后期的经济价值起到关键性的作用。

到目前为止，已经发现了许多可以由植物韧皮部进行远距离传递的内源mRNA分子，比如拟南芥Aux/IAA18和Aux/IAA28(Notaguchi et al.,2012)、南瓜CmNACP(Ruiz-Medrano et al.,1999)、CmPP16(Xoconostle-Cazares et al.,1999)、CmGAIP(Haywood etal.,2005)、番茄the PFP-LeT6fusion gene(Kim et al.,2001)、马铃薯StBEL5(Banerjeeet al.,2006；Hannapel,2010)、POTH1(a KNOTTED1-Like transcription factor)(Mahajan et al.,2012)等草本植物。目前，在木本植物果树上鉴定到的可以进行远距离传递的内源mRNA分子，有苹果内源的GAI(Xu et al.,2010)、梨内源的KN1(张文娜，2012)、GAI(Zhang et al.,2012)、NACP(Zhang et al.,2013)、WoxT1(Duan et al.,2015)。这些mRNA分子能够从砧木传递到接穗，影响接穗的生理和发育进程。因此，通过对砧穗间远距离传递mRNA分子进行鉴定和机理研究，不仅可以为mRNA在植物远距离传递机理以及砧穗间互作机理研究提供理论基础，而且也可利用发现的可传递mRNA开发一种可以定向改良接穗性状的新型砧木育种方法，进而通过嫁接手段来调控接穗性状，既避免收获转基因产品，又可得到特定优良性状产品，达到提高经济效益的目的，还可为今后园艺作物育种及生产提供指导。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中合成萜类物质的第一个重要限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点(Bach,1986；Choi et al.,1992)，在植物的生长发育过程中起到非常重要的作用。在植物中HMGR多肽链部分都是由N-末端区、连接区、跨膜区和C-末端区这四部分组成，其中C-末端催化区域由基因中的近3’端编码形成，且在多数植物中高度保守(Roberts,2007)。目前，梨属的杜梨PbHMGR1已经被克隆得到(黄晶等，2015)，其mRNA在砧穗间的可传递性也已经被证明。