[发明专利]一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法

说明书

一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它涉及一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。本发明的目的是提供一种不同来源的间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，进而获得大量的胰岛样细胞。为实现上述目标，具体方法如下：1)脐带、胎盘或脂肪来源间充质干细胞的分离及原代培养；2)分化培养基的制备包括：制备脑组织条件培养基(BTCM)、细胞分化诱导液以及干细胞条件培养基(SCM)；3)三阶段诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化；4)获得的胰岛样细胞的鉴定。通过本方法获得胰岛样细胞成熟度高，较少的细胞数量即可达到快速降糖作用，具有广阔的应用前景，本发明应用于生物医学领域。

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的应用。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢性、多因素疾病，由绝对(I型糖尿病)和相对的(II型糖尿病)胰岛素缺乏导致高血糖症，两者之间的共同点均是胰岛β细胞功能不足，临床早期无明显症状，症状期会出现三多一少现象，常常伴随身体多系统的损害，严重伤害身体，甚至威胁生命。I型糖尿病的发病原因主要是自身免疫反应导致胰岛β细胞破坏，无法维持葡萄糖水平的稳定。胰岛移植，特别是对重症患者，是一种更直接的治疗方法，但由于供体缺乏、胰腺/胰岛分离费用高、移植产生的炎性反应需要多次移植和长期服用免疫排斥药物等问题而未能在临床上广泛应用。糖尿病患者胰岛功能的改善对延缓并发症的发生尤为重要，借助干细胞技术，在糖尿病患者体内重建内源性胰岛素分泌系统，成为再生医学领域中备受关注的研究方向。干细胞具有多向分化潜能，其中间充质干细胞(MSCs)是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏等多种组织细胞。脂肪、脐带和胎盘来源的MSC具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污染的概率较小，无伦理学限制等优点，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞(IPCs)，此方法成为替代现有短缺的胰岛细胞、实现临床糖尿病治疗的重要研究途径。研究表明，胰腺内分泌细胞来自内胚层，并且表达神经元标志物，同时在脊椎动物的大脑中发现胰岛素基因转录，这些结果都显示胰岛细胞与神经元存在相似之处，因此在神经元条件培养基的作用下可能更有益于胰岛样细胞的生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，利用新出生的鼠大脑制备脑组织条件培养基(BTCM)，利用阿糖胞苷、尼克酰胺、B27、Conophylline等诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞，并通过进一步的鉴定来探讨间充质干细胞的分化潜能，同时寻找一种高效的胰岛样细胞的分化体系，为间充质干细胞分化为成熟胰岛样细胞的临床应用奠定基础。

本发明的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它按照以下步骤进行：

一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；

二、分化培养基制备

所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；

所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；

所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；

所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；