[发明专利]一种钙黄绿素可视化RT‑LAMP试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括引物组、钙黄绿素、氯化锰；

所述引物组如下：

上游外引物F3：5’-CGTGGATGGTCAAAGTCGT-3’；

下游外引物B3：5’-ACCTACACTCCAGGAAGGAC-3’；

上游内引物FIP：

5’-TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA-3’；

下游内引物BIP：

5’-TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC-3’；

环引物LoopF：5’-AGCCTAGATTCGCACTCCG-3’；

环引物LoopB：5’-CGAGGAGACTACCCACGTT-3’。

2.根据权利要求1所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，还包括新型鸭呼肠孤病毒RNA模板。

3.根据权利要求1所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，还包括：RNase-free water、10倍反应缓冲液、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。

4.根据权利要求1所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，还包括：2.5mmol/L的dNTPs、5mmol/L的甜菜碱、100mmol/L的MgSO₄、625mmol/L的钙黄绿素、25mmol/L的MnCl₂、8U/μL的Bst DNA聚合酶和10U/μL AMV的反转录酶。

5.根据权利要求1所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述外引物F3+B3的浓度为10μmol/L，所述内引物FIP+BIP的浓度为10μmol/L，所述环引物LoopF+LoopB的浓度为10μmol/L。

6.一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，包括步骤：

(1)配制RT-LAMP反应体系：加入钙黄绿素、氯化锰、硫酸镁、甜菜碱、dNTPs、AMV酶、Bst聚合酶、10倍反应缓冲液、上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LoopF、环引物LoopB以及测试样品；

(2)反应：将步骤(1)配制好的反应体系反应，在59～66℃恒温条件下反应，然后灭活；

(3)结果判读：

在自然光或紫外光下判读反应的结果或者二者结合判读:

在自然光下，反应产物为绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在自然光下，反应产物为橙色，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒；

在紫外光下，反应产物为荧光绿色，说明测试样品中含有新型鸭呼肠孤病毒；在紫外光下，反应产物为浅蓝色或接近透明，说明测试样品中不含新型鸭呼肠孤病毒。

7.根据权利要求6所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，钙黄绿素和氯化锰终浓度比为1:8～1:128，硫酸镁的终浓度为1mmol/L～6mmol/L，甜菜碱的终浓度为0.5mmol/L～1.5mmol/L，dNTPs的终浓度为0.2mmol/L～0.6mmol/L，AMV酶的终浓度为0.06U/μL～0.16U/μL，Bst聚合酶的终浓度为0.08U/μL～0.48U/μL，10倍反应缓冲液的终体积分数4％～16％。

8.根据权利要求6所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，内引物与外引物的终浓度比为2:1～12:1，环引物与外引物的终浓度比为0～6:1。

9.根据权利要求6所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，恒温反应的时间为10min～60min。

10.根据权利要求6所述的钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，灭活的条件为温度85℃、时间5min。