[发明专利]基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法

权利要求书

1.基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后用一体三步法培养，最终获得完整龙脑樟组培苗。

2.根据权利要求1所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：

(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有3～8个节间的长茎段作为外植体，用软毛刷轻刷表皮泥土及粉尘，进行表面消毒处理后，将其切成0.3～1 cm带节间的单茎段备用；

(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7 d后诱导出芽点，15 d后诱导出0.8～1.5 cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长15 d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养20～30 d后，当苗高长至2.5～4 cm后，准备炼苗、移栽；

(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内1～2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1～3天，期间每天要补充10～15 ml无菌水至瓶内，此后将培育出的组培苗夹出，洗净根部培养基，准备移栽；

(4)移栽：用800 ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30 min后，取出，用稀黄土水沾根后，移栽入酸性土壤的移植袋中生长，待苗木长至6～8 cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；

(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度 15～28 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度70～85%，覆盖遮阴率 80%遮阳网，每周喷洒1 次杀菌剂，每半月施一次氮、磷、钾复合肥。

3.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为0.1～0.2% 洗洁精的水中浸泡30 min后，流动的水冲洗2～3 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒10～30 s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1 wt.%升汞消毒10～20 min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。

4.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：培养基A配方为：改良MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；培养基B配方为：1/2改良MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L +活性炭1 g/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。

5.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立，其特征在于：环境Ⅰ为：温度25±2 ℃、光强2000～3000 Lx、12 h/d光照不间断培养。

6.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：环境Ⅱ为：在黑暗条件、温度为23±2 ℃下培养。

7.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：环境Ⅲ为：温度25 ℃、光强1500～2000 Lx、8 h/d光照不间断培养。

8.根据权利要求2所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：步骤（5）杀菌剂为：50% 多菌灵与70% 甲基托布津交替使用。