[发明专利]A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途，本发明属于核酸检测技术领域。本发明的试剂盒内设有阳性对照、阴性对照以及用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物。使用本发明所公开的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测三种引起腹泻的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别涉及一种能够同时检测A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒的多重荧光PCR检测试剂盒，属于核酸检测技术领域。

背景技术

腹泻是我国的常见病、多发病，感染的病原主要为病毒等，感染者从倦怠﹑乏力﹑低热等，甚至全身感染，脑﹑脊髓﹑心﹑肝等重要器官受损，可呈现不同的症状，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。因此对腹泻病原体的快速、准确的诊断十分必要。同时腹泻病原体的种类繁多，给诊断带来巨大挑战。人星状病毒(Human Astrovirus，HAstV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷人群腹泻的重要病源之一，在全球范围内广泛存在，既可引起散发性腹泻，也可以引起暴发性腹泻。人腺病毒共有51个血清型，分属A～F 6个亚组。F组又分为腺病毒40型(Ad40)和41型(Ad41)，称为肠道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdV)。EAdV是引起全球婴幼儿急性重症腹泻的重要原因，被认为与幼儿园、学校和医院中散发腹泻和暴发腹泻有关。轮状病毒(Rotavirus，RV)是秋冬季婴幼儿腹泻最常见的病原，位居小儿腹泻第一位(约占40％)。根据病毒外壳抗原可分为A～G 7个不同的组，A组在流行学和疫苗方面最为重要。RV全球范围广泛存在。

目前，临床上常用的腹泻病原体检测方法为试纸条法(酶联免疫吸附法，ELISA)，此法虽然时间短，但是敏感性较低，且受到抗体动力学的影响。荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。

公开号为CN104561376A，发明名称为一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒的专利申请公开了一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，还设有分别用于检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮状病毒中一种或多种病毒的多种引物及探针序列的混合物。根据该专利文献所述，5种肠道病原体检测分为两个反应，反应一包括诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2和内对照；反应二包括腺病毒、星状病毒和轮状病毒。因此，该专利申请实则进行了两个三联检测。在进行腺病毒、星状病毒和轮状病毒检测时并没有添加内标，因此无法对样本核酸进行外部控制。此外，该专利申请将Cy5、FAM和YAK荧光素分别标记腺病毒、星状病毒和轮状病毒。Cy5荧光素本身的荧光值较低，在低浓度时会造成荧光值太低被仪器认为是阴性，从而造成腺病毒的假阴性结果。

针对现有技术中的问题，本发明提出了一种能够同时检测A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸的多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒同时含有检测星状病毒、肠道腺病毒、轮状病毒A组和人内标基因actin的引物以及探针，因此为4联检测试剂盒。本试剂盒添加内标，可对样本进行外部控制，在星状病毒、肠道腺病毒和轮状病毒A组都为阴性的情况下，如果内标也为阴性，说明样本降解或核酸含量较少或存在抑制，需要重新提取核酸或进行纯化处理。本试剂盒选用常用的FAM、HEX和ROX荧光素分别标记星状病毒、肠道腺病毒和轮状病毒A组，能够保证病原体在低浓度时有明显的扩增曲线；将本身荧光值不太高的Cy5标记内标，因actin的浓度一般较高，Cy5有正常的扩增曲线。此外，本发明发明人通过PCR平行对比试验证明，本发明的试剂盒相较于公开号为CN104561376A专利申请所公开的试剂盒具有更优异的检测效果。