[发明专利]一种便捷的高性能胶原凝胶的制备方法

说明书

本发明公开了一种便捷的高性能胶原凝胶制备方法，其特点是将自组装胶原凝胶置于醇类溶液中进行梯度脱水从而使得胶原凝胶中的溶剂被醇类溶液替换，并使胶原凝胶的尺寸发生一定程度的收缩，制备得到高性能胶原凝胶。整个工艺操作简单，耗时较短，约18‑34h；工艺的温度不会使胶原发生变性；所制备的高性能胶原凝胶的弹性模量达到了未处理胶原凝胶的11‑53倍，广泛用于组织修复、药物缓释和临床医学等领域。

技术领域

本发明涉及一种便捷的高性能胶原凝胶制备的方法，属于生物医用材料的制备领域。

背景技术

胶原作为细胞外基质的主要成分，是动物体内含量最多的蛋白质，广泛存在于皮肤、血管和肌腱等哺乳动物的结缔组织中，保护和支撑动物器官。作为一种天然高分子材料，由于胶原的天然三股螺旋结构，使得胶原具有低免疫原性、生物相容性、可生物降解性和止血修复功能等特性，并且在药物传递、组织工程、临床医学等领域有着广泛的研究和应用。

凝胶是由三维网络结构的高分子和填充在高分子链段间隙的介质构成的半固体材料，由于其具有固体和液体两方面的性质，包括弹性、伸缩性、保水性、吸水性和缓释性等特点。当胶原溶液在生理条件下，胶原分子可以依靠氢键、疏水键、离子键等非共价键进行自组装，由胶原纤维形成的致密网络结构可以束缚大量的水分形成自组装胶原凝胶。由于胶原凝胶和其他合成高分子凝胶相比具有独特的生物学性质，近年来，在生物医学材料领域的研究受到了众多关注。

胶原分子自组装形成的胶原凝胶的热稳定性和机械性能较弱，不能满足其在在矫形外科、心血管外科和神经外科临床领域的应用。目前研究通常采用以下的方法改善胶原凝胶的性能：(一)、通过热处理、γ射线、紫外光等方法使胶原分子内部发生交联，从而提升胶原凝胶的力学性能。如Mori等人发现加热处理和γ射线处理猪皮胶原凝胶能够提升其力学性能，5kGy的γ射线处理3mg/mL的胶原凝胶后，胶原凝胶的弹性模量达到了325Pa，是未交联胶原凝胶的7倍左右，γ射线的处理对于凝胶力学性能的提升不够明显，并且γ射线处理的成本相对较高；加热处理会显著提升胶原凝胶的性能，将125mmol/L的EDC交联胶原凝胶置于80℃下处理30min后，其弹性模量达到7010Pa，和未加热处理的凝胶相比提升了31倍(Hideki Mori,Kousuke Shimizu,Masayuki Hara.Dynamic viscoelastic properties ofcollagen gels in the presence and absence of collagen fibrils)，然而猪皮胶原凝胶的热变性温度约为47℃(Shunji Yunoki,Nobuhiro Nagai,Takeshi Suzuki,MasanobuMunekata.Novel biomaterial from reinforced salmon collagen gel prepared byfibril formation and cross-linking)，猪皮胶原溶液的热变性温度约为37.5℃(乔恩楠，张传杰，颜超，刘云，崔莉，朱平结构蛋白-猪皮胶原的提取及其理化特性的表征)，较高的温度(80℃)处理会引起胶原的部分变性，可能导致胶原凝胶材料失去胶原的生物学性质。(二)、引入交联剂如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺类(NHS)、碳化二亚胺类(EDC)等，通过共价交联键的形成提升胶原凝胶的性能，胶原凝胶的机械性能与所用交联剂密切相关，此外还要考虑残留交联剂在应用上的细胞毒性。EDC、NHS类交联剂对于胶原凝胶的性能提升不够明显，如Duan等人使用牛皮胶原溶液(其热变性温度约为41℃(沈菊泉，汤俊，沈亚领，马志英酸法制备牛皮胶原蛋白及其结构性质研究))在37℃下自组装制备得到自组装胶原凝胶，再使用己二酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯交联自组装牛皮胶原凝胶，当交联度达到45.3％时，胶原凝胶的弹性模量为156.3Pa，是未交联胶原凝胶的1.8倍(Lian Duan,Wentao Liu,Zhenhua Tian,Conghu Li,Guoying Li.Properties of collagen gels cross-linked byN-hydroxysuccinimide activated adipic acid deriviate)；Mori等人使用125mmol/LEDC交联3mg/mL自组装猪皮胶原凝胶后，交联的胶原凝胶弹性模量达到226Pa，是未交联的胶原凝胶的5.1倍(Hideki Mori,Kousuke Shimizu,Masayuki Hara.Dynamicviscoelastic properties of collagen gels in the presence and absence ofcollagen fibrils)。戊二醛对于胶原凝胶的弹性性能提升较为明显，Tian等人使用0.3mg/mL的戊二醛交联5mg/mL自组装胶原凝胶后发现交联胶原凝胶的弹性模量为2243.05Pa，是未交联胶原凝胶的20倍(Zhenhua Tian,Wentao Liu,Guoying Li.The microstructureand stability of collagen hydrogel cross-linked by glutaraldehyde)，但是戊二醛含有较高的细胞毒性，不利于在体内的应用(Ming-Thau Sheu,Ju-Chun Huang,Geng-ChangYeh,Hsiu-O Ho.Characterization of collagen gel solutions and collagenmatrices for cell culture)。(三)、通过自组装、交联、热处理和光处理等手段结合的方法对胶原凝胶进行处理制备得到了高强度的胶原凝胶。如Mori等通过以下方法获得弹性模量很高的胶原凝胶：1.将猪皮胶原在体外生理条件下自组装,37℃下过夜(约12h)后得到初自组装胶原凝胶；2.将自组装胶原凝胶置于EDC溶液中过夜(约12h)得到交联胶原凝胶；3.将获得的交联胶原凝胶置于超低温的环境中(-85℃)冷冻过夜(约12h)，然后将冷冻的凝胶冷冻干燥后(约24h)得交联胶原海绵；4.在4℃条件下，将交联胶原海绵置于生理条件下的胶原溶液中浸泡，然后继续重复1-4步骤。结果发现125mmol/L的EDC进行交联，在3次循环后得到的胶原凝胶的弹性模量可以达到3730Pa，是自组装胶原凝胶的85倍(Hideki Mori,Kousuke Shimizu,Masayuki Hara.Dynamic viscoelastic properties of collagengels with high mechanical strength)，虽然这种方法可以获得力学强度很高的胶原凝胶，但是整个工艺需要7天左右，耗时较长并且操作步骤较为繁琐，超低温的冷冻干燥成本较高；中国发明专利CN104231288A使用1-50kGy的γ射线或高能电子束辐射交联胶原水溶液或其与其他天然高分子、水溶性合成高分子、乙烯基类单体的混合水溶液制备得到低密度胶原水凝胶，然后将低密度胶原凝胶置于30-40℃中2-72h，使其发生三维尺寸收缩，制备得到的胶原凝胶压缩模量和未处理的胶原凝胶相比提升了2-5倍，这种方法获得胶原凝胶的性能提升不明显并且会引入其他高分子材料。