[发明专利]一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法。

背景技术

原始生殖细胞细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子的前体并且是繁殖的中心。生殖细胞谱系的精确自我更新是生育和繁殖成功的基础。在禽类物种中，PGCs在胚胎发生期间比在哺乳动物中更早形成,在雌性中它最终发育为卵细胞,在雄性中最终发育为精子。在胚胎中的迁移途径—通过血液循环后移植入性腺,使它能成为冷冻保种的目标细胞,同时成为转基因禽类制备中的良好载体。由于PGCs能够发育成为有功能的配子,它作为载体携带外源基因,制造性腺嵌合体乃至制备转基因动物,具有较高的研究价值。

目前在鸡原始生殖细胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)的培养中大量采用有血清、饲养层培养体系培养，而这种培养体系存在一定的缺陷，如何获得一种更方便、无不明确物质成分的体外培养方法显然成为cPGCs培养的关键。血清是一种成分极其复杂的外源物质，在实验和应用中无法确定是血清中何种组分影响了细胞行为。饲养层细胞是指一些特定细胞经有丝分裂阻断剂处理后得到的细胞单层。目前所采用的饲养层主要有STO细胞株、鸡胚胎原代成纤维细胞(PCEF)、性腺基质细胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)等，均能不同程度促进细胞增殖和分泌白血病抑制因子(LIF)以及产生其他分泌物以抑制其分化。由于这些分泌物质成分尚不清楚，在研究细胞分化的分子机制方面产生一定的干扰；在基因修饰的研究中，需要通过药物筛选获得稳定表达目的基因的cPGCs，通常采用含有抗性基因的饲养层来进行培养筛选，而这种有饲养层体系的培养将实验复杂化，增加了实验的操作难度，且药物筛选后对饲养层造成的破坏也会影响细胞生长；另一方面，这些细胞需要丝裂霉素处理阻断其有丝分裂后用作饲养层细胞，即使是极其微量的丝裂霉素残留也会对cPGCs细胞的生长造成影响；非禽类的异源细胞用作饲养层饲养时，也会对cPGCs细胞产生一定的影响；动物源性的血清和饲养层细胞的污染物会污染细胞自身的应用。此外，饲养层的使用以及血清的添加也一定程度的延长了实验的时间，增加了实验经费的投入。

因此，建立cPGCs无血清、无饲养层培养体系可以为以后在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产、药物筛选、家禽育种等方面提供巨大贡献。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法，其具有成分明确、方便操作、减少污染、降低成本、避免细胞受损等优势，应用前景广阔。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种培养cPGCs的完全培养基，包括KO-DMEM、B-27supplement、NAA、nucleosides、GlutaMAX II、β-巯基乙醇、卵清蛋白、OVT、肝素钠、Activin A、TGF-β1、BMP4、FGF-2、IGF-1。

进一步，以KO-DMEM为基础培养基，并添加20-30ng/ml的BMP4、20-30ng/ml的TGF-β1、20-30ng/ml的Activin A、5-20ng/ml的OVT、1-5ng/ml的FGF-2。

进一步，以KO-DMEM为基础培养基，还包括其1-2％的50X B-27supplement、1％的100X NAA、1％的100X nucleosides、2.0mM GlutaMAX II、0.1mMβ-巯基乙醇、1-2％卵清蛋白、0.5％-2％肝素钠，均为体积比。

进一步，还含有以KO-DMEM为基础培养基，体积比0.5％-2％的三抗，所述三抗由青霉素、链霉素、两性霉素B组成。

一种培养cPGCs的完全培养基的使用方法，包括以下步骤：

(1)采集的14HH鸡胚血液置入含有cPGCs完全培养液的培养体系中培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(2)将纯化后cPGCs细胞重新置入cPGCs完全培养基进行体外培养扩增；

(3)对体外培养扩增的cPGCs进行计数、间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明打破了有血清、有饲养层的传统培养方法，培养基的成分明确，便于研究细胞分化的分子机制。

(2)本发明避免了异源细胞作为饲养层后产生的不利影响。

(3)本发明避免了制备饲养层时一些药物残留，降低了对细胞的不良影响。