[发明专利]在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌。所述方法包括构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种；构建包含启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的表达载体；将上述载体导入上述枯草芽孢杆菌中。本发明分别组合优化了表达普鲁兰酶的启动子和信号肽，最终得到了一系列能高效表达普鲁兰酶的启动子和信号肽，为普鲁兰酶的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌。

背景技术

淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉占淀粉含量的15％-25％，由线性的葡萄糖以α-1，4糖苷键构成；支链淀粉占75％-85％，由若干个寡糖链以α-1，6糖苷键结合在主链上形成分支结构。由于淀粉结构的特殊性，需要多种酶协同作用才能把高分子的淀粉降解为寡糖、二糖和单糖。普鲁兰酶因其能专一性地水解支链淀粉的α-1,6糖苷键的性质决定了其在增强淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量和开发新产品方面有着巨大的价值，在淀粉加工相关行业有着重要的用途和良好的市场前景。

目前限制普鲁兰酶产业化应用的主要问题是普鲁兰酶生产菌的发酵活力低，生产成本高。将普鲁兰酶进行异源表达是提高普鲁兰酶发酵酶活的有效方法之一。相对于大肠和毕赤酵母表达系统，枯草芽孢杆菌具有以下优点：枯草芽孢杆菌是食品级的表达系统、具有较强的分泌蛋白质的能力、良好的发酵基础和生产技术等。目前许多研究人员尝试用枯草芽孢杆菌表达普鲁兰酶，但表达酶活都比较低。通过分析发现以下几个因素影响了普鲁兰酶的表达：(1)枯草芽孢杆菌自身会分泌大量的蛋白酶，这些蛋白酶会分解表达的普鲁兰酶；(2)没有找到合适的启动子和信号肽；(3)表达质粒随着传代次数的增加，容易丢失。为了提高普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌的表达，必须解决好以上所提到的问题。

本专利以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过基因敲除技术缺失了枯草芽孢碱性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因得到枯草芽孢突变菌株Bs-vtr。其次以Bs-vtr为宿主，组合优化了普鲁兰酶的表达元件启动子和信号肽，最终得到一系列高效表达普鲁兰酶的枯草芽孢菌种，为普鲁兰酶的工业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是减少枯草蛋白酶对重组普鲁兰酶的影响，通过敲除了枯草碱性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因，得到了枯草突变菌株，然后导入包含优化的启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的重组载体，高效表达普鲁兰酶。

根据本发明的枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法包括步骤：

构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种；

构建包含启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的表达载体；

将上述构建的表达载体转入碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种，培养获得普鲁兰酶，

其中，所述启动子为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，和/或来源于苏云金芽孢杆菌的启动子中的一种或多种，

所述信号肽为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，和/或地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽中的一种或多种。

根据本发明的具体实施方式的在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法，其特中，所述启动子为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，所述信号肽为枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽。

根据本发明的另一在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法包括步骤：

构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种；