[发明专利]基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素

说明书

技术领域

基于核酸适配体(aptamer)的胶体金(AuNPs)层析试纸条检测四环素(TET)，属于分析化学技术领域。

背景技术

四环素类抗生素作为一种广谱抗生素被广泛地用来控制细菌感染，在动物疾病的治疗中发挥着举足轻重的作用。其中，四环素因高效性、广谱性和低成本性等特点，已成为应用最为普遍的一类抗生素。四环素不仅作为药物广泛地应用于人类与动物疾病的预防与治疗，同时也作为饲料添加剂被大量地使用，用于提高饲料利用效率和促进动物生长。

然而，四环素化学性质相对稳定，且具有一定的持久性，造成了其在环境中的残留，大量研究证实了四环素广泛存在于土壤和生态水中。不仅如此，在动物饲料中过度和不适当的添加会造成四环素或其降解产物高水平的残留与累积在动物源性食品中，如牛奶、肉类、鱼类和鸡蛋。

当人们摄入带有四环素残留的这些食物，可能会造成牙齿发黄，机体耐药性增强、过敏反应、胃肠道紊乱以及肝损伤，严重威胁人体健康。

因此，为保障人体健康，许多国际组织规定了四环素在食品中的最大残留限量(MRL)，如美国食品药品管理局、欧盟和联合国食品法典委员会限定牛奶中四环素的MRL分别为900nM、225nM和100μg/Kg。而我国农业部允许四环素在牛奶中的MRL为100ng/mL。

目前，四环素的常用检测方法是色谱分析方法，如毛细管电泳法、高效液相色谱法、液相色谱—质谱联用法等，这些方法大多需要漫长而复杂的分析过程、昂贵的仪器以及专业人员的操作，并不适合于现场快速检测。另一种常用的检测方法是酶联免疫吸附法，虽然其检测灵敏度较高，但是选择性差，且费用较为昂贵。因此有必要研发出既有较好选择性和灵敏度，又简便、经济、易于操作，更适于现场快速检测的四环素检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素的方法，以快速、简单、灵敏地检测四环素的残留量。

技术问题：基于核酸适配体的胶体金试纸条检测四环素基于以下原理：

基于aptamer的试纸条设计方法的原理是基于DNA探针1(测试线)及目标TET与aptamer结合的竞争反应。如果检测液中存在TET，将与aptamer-AuNPS探针结合，减少了与DNA探针1杂交的aptamer-AuNPS，使检测线上红色的颜色强度变弱。换句话说，溶液中的目标TET越多，测试线的强度较弱；无论目标TET的在检测溶液中是否存在，aptamer-AuNPs探针一定会在控制线与DNA探针2杂交，以确保检测的效度。评估此方法的灵敏度是根据试纸条的视觉检测限，即最小目标浓度在测试线上的颜色与不用靶分析的阴性对照条带的测试线有显著不同的颜色。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成；胶体金与核酸适配体的组装与偶联；链霉亲和素和DNA链的组装；样品垫与金标垫的前处理；NC膜划线；试纸条的组装；四环素标准品的检测；选择性和特异性实验；实际样品的检测。

(1)适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成

①样品制备

对于所有制样的玻璃器皿彻底用王水(盐酸/HNO₃，体积比3:1)清洗然后烘干备用。100mL的0.01％氯金酸溶液彻底煮沸，并在不断搅拌下迅速加入2.5mL的1％的柠檬酸三钠溶液。将溶液再煮沸10min时，溶液的颜色在1min内从蓝色变为酒红色。目测所制备的胶体金溶液，颜色呈鲜亮的酒红色，分布均 匀，无明显颗粒沉淀物或漂浮物。在室温搅拌下冷却后，将溶液贮存于4℃黑暗中做进一步研究。所制备AuNPs的尺寸分布是由紫外分光光度计检测吸光度确认。

②参数

紫外分光光度计型号为UV-2550；光谱值范围为400nm到800nm；扫描速度为60nm/分钟；带宽为100nm；数据间隔为1nm。将测得的OD值利用Origin软件进行处理并作出OD色谱图。

(2)aptamer-胶体金的组装与偶联