[发明专利]一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法

说明书

本发明提供了一种一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，采用ARTP及三次¹³⁷Csy诱变使链霉菌发生突变，并采用2次原生质体融合进行基因重组。有益效果为：经过四轮诱变与两轮原生质体融合，得到融合高产菌株G2‑31，其阿维拉霉素效价达到2842.57 mg/L，是原始菌株11‑10的4倍，经连续传代试验，菌种状态稳定，表现出较高的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及微生物选育技术领域，具体是一种一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法。

背景技术

阿维拉霉素(Avilamycin)又名卑霉素，是由绿色产色链霉（Streptomycesviridoehrongenes）经过发酵产生的一种寡糖类抗生素，由美国礼来公司最先研制开发并命名为效美素(Maxus 100)由于其独特的结构所导致的高安全性，其易降解导致的在肠道基本无残留和对环境污染小以及毒性小、不存在交叉耐药性等特点，因此被广泛用于畜禽饲料中作为添加剂使用，而且无需停药期。目前阿维拉霉素在世界上主要的养殖业国家，比如欧盟、日本、巴西等被大量使用，而在2005年被我国农业部批准进口使用[进口兽药再注册目录，(2005)外兽药证字56号]。近年来，我国对阿维拉霉素的生产研究也在相应的增加，有关的报道也在逐年的增加。

国内外对绿色链霉菌及阿维拉霉素的研究基本上仍处于实验室研究阶段。研究内容包括菌种选育、培养基和培养工艺对细胞生长和阿维拉霉素生成的影响、链霉菌细胞内阿维拉霉素的提取与测定等。但至今仍存在一些关键问题有待解决，主要是阿维拉霉素合成的详细途径及调控因子不明确，无法确定阿维拉霉素生产运输机制等。总体归纳有三点：C1)对链霉菌产阿维拉霉素的基因调控及代谢网络了解不深；C2)主要采用传统育种方法，工作量大，机会性强；C3)筛选手段不精心设计、效率低、工作量大。因此探索新的途径和手段，获得高产阿维拉霉素链霉菌菌株就成为产业化发展的关键问题和核心技术。

现有技术如中国知网中论文：王庆龄. 阿维拉霉素高产菌株选育[D]. 浙江工商大学， 2015.公开了阿维拉霉素是一种正糖霉素族中的寡糖类抗生素，作为一种新型促进消化和代谢调节饲料药物添加剂，以其高安全性、低毒性以及低残留被欧盟等国家批准使用。本文通过诱变及基因组重排的方法并结合利福平抗性压力，选育了高产阿维拉霉素生产菌。通过rpoB序列分析，阐述了重组菌利福平遗传抗性及代谢特性。建立了发酵液中阿维拉霉素无盐相液相色谱测量法。该论文公布的高产阿维拉霉素生产菌产阿维拉霉素的产率还有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无化学污染、安全性高、成本低、突变率高的诱变方法，效率高且能提高正向突变率的筛选方法，选育出阿维拉霉素产率高的菌株。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，具体步骤：

1）ARTP及第一次¹³⁷Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及¹³⁷Csy诱变，ARTP照射时间为170~210s，较高的致死率有利于淘汰亲本和筛选突变株，同时等离子诱变时间不能过长。琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存。等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；

2）第二次¹³⁷Csy诱变：再次用¹³⁷Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；