[发明专利]外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用

说明书

本发明提供了外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用，肿瘤患者的外周血中的游离外泌体的特异性标志物CD9的表达水平明显高于对照组健康个体中的外泌体CD9的水平，其作为肿瘤诊断标志物的特异性和敏感性高。本发明还提供了用于肿瘤诊断的试剂盒，包含检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂：(1)用于从外周血中分离总外泌体的总外泌体分离试剂；(2)用于从所述总外泌体中提纯肿瘤来源外泌体的EpCAM分离磁珠；(3)用于检测所述肿瘤来源外泌体中特异性标志物表达的Elisa检测试剂。该试剂盒可以用于进行肿瘤诊断与监控，尤其是进行肿瘤高危人群的筛查、早期无创诊断或患者的预后评估。

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学及生物检测领域，具体涉及外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害我国人民生命健康的第一大疾病。随着我国现代化建设不断加快和日益严重的环境污染，癌症的发病率还呈明显上升趋势。

活检术是临床用来对可疑肿块进行病理学确诊的最常用方法，然而从原位肿瘤不同部位及转移灶的穿刺组织的基因组学研究发现肿瘤存在显著的异质性，而该技术仅可以向患者提供疾病进展单一方面的信息。而且，肿瘤组织活检方法是侵入性的，会对患者造成侵入性创伤，对患者而言非常疼痛且费用昂贵。至于CT、B超等常规影像学检查，更加只能从肿瘤大小与性质上进行判别。显然，目前的检查方式无法满足更精准的个体化治疗需求。因此，开发研究新的、能早期的、方便的、能监控的肿瘤无创诊断新方法在我国有重大需求。

液态活检是一种非侵入式的无创血液测试，能监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)，循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片或者外泌体，是检测肿瘤、辅助治疗的突破性技术。

其中，体液活检检测循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)或循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是目前被评价最有前景临床转化的肿瘤监测方法。但是，由于外周血中CTCs数量稀少，且具有异质性和易聚集成团等特点，目前的体液活检CTCs检测方法存在假阳性或假阴性较高的问题亟待解决。同样，由于血液中多数循环DNA并非起源于肿瘤，外周血中ctDNA的数量也非常少，而用于痕量DNA分子的检测和定量分析的现代DNA测序技术的敏感性极高，从而增加了检测的非特异性。而且，目前最灵敏的ctDNA检测技术，比如BEAMing 等技术，依赖的都是已经非常明确的待测突变，但是这些突变信息还是只能通过组织活检的方法才能够获得。也就是说，我们只能先进行组织活检，对标本进行测序，发现突变位点信息之后，根据这些突变信息设计出特异性的探针，然后才能够进行ctDNA液体活检。不过也可以像Rosenfeld等人那样进行全外显子组测序。这就不需要预先知道突变信息，但是目前进行这种测序的成本非常高，还不太现实。此外， ctDNA数量变异度非常大(早期和晚期肿瘤释放的ctDNA数量差异非常大)，并且有非常大的个体差异，ctDNA检测技术对于早期肿瘤患者的检测效果并不太好。因此，ctDNA检测技术目前仍不太适合应用于临床。

癌细胞在生殖和转移过程中会分泌外泌体(Exosome)。外泌体是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在体液如血清、血浆、尿液中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，因此提取细胞外的外泌体用于疾病、肿瘤等的诊断、监控有巨大的应用潜能。

发明内容