[发明专利]人静脉内皮细胞的分离和体外扩增方法

说明书

本发明一种从人脐带静脉中获取人静脉内皮细胞的方法，包括人静脉内皮细胞的分离和体外扩增人静脉内皮细胞，该人静脉内皮细胞的分离是先用酒精固定脐静脉外层细胞，再利用胶原酶消化脐静脉内皮细胞，收集到相对较多、较纯的脐静脉内皮细胞；人静脉内皮细胞的体外扩增培养过程中使用血小板裂解物而无任何动物源及血清成分，免除细胞培养过程中动物性异源成分及血清对细胞应用的潜在威胁。用本发明方法获得的人静脉内皮细胞可用于新生血管机理的研究、抗肿瘤新生血管药物的筛选中。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域中细胞的分离和扩增，特别是涉及一种人静脉内皮细胞的获取，包括分离和体外扩增的方法。

背景技术

内皮细胞有较多生物学功能，可应用于动脉粥硬化的血管重塑，减轻血管损伤，预防心血管疾病；缓解糠尿病患者下肢缺血症状，防止非创伤截肢的发生；此外，内皮细胞在以血管生成为靶向的药物研究以及组织再生、创面愈合方面均有正面报道。

脐静脉内皮细胞的分离方法包括：机械刮取、组织块移植、组织消化后磁珠分选法和胶原酶灌浆法。前两种方法细胞阳性率较低，第三种方法成本较高，目前均以第四种方法为主，但该方法要向脐带静脉中灌入酶液，而且需要维持消化温度等，操作不方便，还要求样本必须长度在20厘米以上，过短会导致收集细胞数量过少，此外，在操作过程中常有其它污染物带入。

在内皮细胞的培养过程中，目前的培养方法中都添加较多的胎牛血清、马牛血清等动物源成分，以满足内皮细胞生长过程中对营养的需要，但是存在异种蛋白及未知污染源等问题。

如申请号为200810222274.X、公开日期为2009年1月28日、发明名称为《一种血管内皮细胞及其制备方法与应用》的中国发明专利申请，在其后期内皮细胞的培养过程中加入了大量的马血清和胎牛血清等异源血清，对后期内皮细胞的使用存在安全性风险。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种收集量较多、纯度较高的人静脉内皮细胞的分离方法。

本发明所提供的人静脉内皮细胞的分离方法，是将人脐带静脉先用酒精处理以对静脉外层细胞进行固定，再用胶原酶对静脉内层内皮细胞进行消化，消化结束后，去除人脐带静脉残余组织，将消化液离心，得到人静脉内皮细胞。

在上述人静脉内皮细胞的分离方法中，所述内皮细胞来源于人脐带静脉。

所述人脐带静脉的获得方法为：将人脐带先用生理盐水清洗去除脐带表面和血管中残存的血液，再用镊子和手术刀剥除脐带羊膜及胶质后，挑取人脐带静脉。

所述将人脐带静脉酒精浸泡处理进行固定的目的是使脐带静脉外层细胞失活，当使用胶原酶消化静脉时，因外层细胞固定不易脱落或者脱落下的为失活细胞，而静脉内层内皮细胞很容易消化获得，从而收集得到较多、较纯的内皮细胞，方法为：用止血钳夹住静脉两端，将人脐带静脉在70-75％(优选75％，V/V)酒精中固定3-5s(优选3s)，用生理盐水洗涤。

为了利于消化，需要用手术刀将固定后的人脐带静脉切成长度为3-8cm(优选5cm)的片段。

所述用胶原酶消化脐带静脉组织的方法为：将固定后的人脐带静脉片段用含0.1-0.5％(优选0.1％，M/V)胶原酶I的IMDM(或DMEM/F12、α-MEM等其它细胞培养基)消化液进行消化，消化液加入的体积为1mL消化液/1cm脐带静脉，消化条件为35-38℃(优选37℃)消化20-40min(优选30min)，消化过程中每5-10min(优选10min)摇晃1次。

可使用70-100μm(优选100μm)细胞筛去除人脐带静脉残余组织。

所述离心条件为1500-2000rpm(优选1500rpm)离心8-10min(优选10min)。

具体来讲，本发明所提供的人静脉内皮细胞的分离方法，可包括以下步骤：