[发明专利]同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法

说明书

技术领域

本发明涉及肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1含量的检测方法，尤其涉及同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，属于黄曲霉毒素含量的超高效液相色谱检测领域。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFT)，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，尤其是黄曲霉毒素B1为强污染物质，其分布范围广，主要产生和存在于发霉变质的粮食谷物或其生产制品中。动物食用了含有黄曲霉毒素B1(AFB1)的饲料后，在体内经羟基化代谢会产生黄曲霉毒素M1(AFM1)，二者均具有极强的毒性，能引起人类特别是儿童、各种饲养动物的中毒，还能致癌、致畸、致突变，即使每千克物质中含有几十微克的量仍有很大的毒性，二者均会残留于动物的肝、肾、肌肉等人类可食用部分，对人类、家禽、家畜的健康造成了极大的威胁。

超高效液相色谱方法(UPLC)是分离科学中的一个全新类别，它借助高效液相色谱法(HPLC)的理论和原理，涵盖了小颗粒填料，非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量，灵敏度和色谱峰容量。与传统的HPLC相比，UPLC的灵敏度及分离度均提高了数倍甚至数十倍，且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本，是一种比HPLC更快速、更高效、更灵敏的残留检测方法。因此，建立一种准确、灵敏、高效的超高效液相色谱法检测肉鸡可食用组织中的黄曲霉毒素残留，对保证畜禽产品的安全和维护人类的健康均具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素M1(AFM1)含量的超高效液相色谱方法，该方法使AFB1和AFM1得到充分的提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中AFB1和AFM1含量的超高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定。

步骤(1)所述提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1包括：将待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织粉碎，加入提取溶剂，经超声处理后，摇床震荡，然后加入无水硫酸钠，离心，取上清。其中，所述提取溶剂选自二氯甲烷、70％-100％甲醇溶液或84％乙腈溶液(体积百分比)中的任意一种，优选为二氯甲烷；进一步优选的，按照g/ml计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：提取溶剂＝1：10。所述超声的时间为10min；超声的功率为60Hz；所述摇床震荡的时间为30-90min，优选为60min；所述摇床震荡的转速为400r/min。按照质量比计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织：无水硫酸钠＝1：1。

步骤(2)所述净化包括：将提取液通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，收集洗脱液；其中所述黄曲霉毒素免疫亲和柱选自AFM1免疫亲和柱或AFB1免疫亲和柱中的任意一种，优选为AFM1免疫亲和柱。具体的净化步骤包括：取提取液10ml，50℃水浴条件下氮气吹干，加入2ml甲醇溶解残渣，加入pH7.4 PBS溶液13mL，通过AFM1免疫亲和柱，流速1-2滴/秒，10ml纯水冲洗免疫亲和柱，压入空气排出柱内残余水分，加入1ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液。

步骤(2)所述衍生的方法为三氟乙酸柱前衍生法(参见文献“高效液相色谱法对肉鸡组织样品中黄曲霉毒素B1残留量的测定”，《黑龙江畜牧兽医》科技版，2015年10月(上)281-287.)；衍生后的产物经氮气吹干、定容，用于上样。具体的包括：将洗脱液经氮气吹干，加入三氟乙酸、正己烷，水浴衍生，然后氮气吹干，定容；进一步具体的，收集用1ml甲醇洗脱的全部洗脱液，50℃水浴条件下氮气吹干，加入100μl三氟乙酸、200μl正己烷，40℃水浴衍生15min，50℃水浴条件下氮气吹干。所述定容用的溶液为10％-100％甲醇水溶液或10％-100％乙腈溶液，优选为10％甲醇水溶液(体积百分比)。