[发明专利]可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种可视化检测Hobi‑like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法。本发明合成特异性LAMP引物上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，所述试剂盒包括如下组分：10×Thermo Pol反应缓冲液、dNTP、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、AMV Reverse Transcriptase、Ribonuclease Ihibitor、DEPC水、显色试剂和上述引物。本发明试剂盒特异性强、灵敏性高、快速和可操作性好。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

Hobi-like瘟病毒为2004年从巴西胎牛血清中分离的一种新的瘟病毒，与牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)、猪瘟病毒(CSFV)和羊边界病毒(BDV)同属于黄病毒科。之后又相继在其他国家，如欧洲的意大利、瑞士，大洋洲的澳大利亚，美洲的墨西哥和亚洲的日本、印度和孟加拉等国发现了该病毒分布和存在。该病毒感染牛后表引起的症状与BVDV-1和BVDV-2感染牛表现出的症状相似，临床主要表现为呼吸道、消化道和生殖道疾病，因此某些病毒学研究者将其试命名为“BVDV-3”型。

我国学者2012年从污染的MDBK细胞中首次分离到该病毒，本实验室于2015年首次从患有呼吸道疾病的病羊体内分离到Hobi-like瘟病毒，毒株全基因登录号GenBankKU563155，表明该病毒不仅可以自然感染牛，而且可以感染羊等小反刍动物。目前兽医临床上对该病毒认识还不足够，临床上也没有建立良好的检测方法；只有少量实验室建立了常规的RT-PCR检测方法，套式RT-PCR方法和荧光定量PCR；这些方法往往存在需要精密仪器和特殊实验条件的限制，制约了现地应用。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是当前应用最为广泛的一种核酸快速扩增的新型技术之一，该方法具有方便快速、操作简单、敏感性高、适用性强、结果准确等特点。此方法原理主要利用自动循环的链置换反应，核酸扩增一般可在60min内完成，扩增效率一般高达到10⁹～10¹⁰个数量级。不仅如此，该方法对实验所用的仪器要求非常低，一台普通的水浴锅就可以完成全部实验反应。

中国专利申请CN103924006A公开了一种用于检测HoBi样瘟病毒(HoBi-likepestivirus)核苷酸片段的引物序列，属于动物病原微生物检测技术领域。引物对包括：由序列为TGGTTCGACGCATTAAGGAAT的上游引物HoBi-F和序列为TCTCTGCAGCACCCTATCAG的下游引物HoBi-R组成的引物对。该套引物序列根据GenBank上HoBi样瘟病毒5′-UTR基因序列设计，具有较高的灵敏度和特异性。但是，该专利引物所针对的序列并不能完全匹配某些经典毒株所对应的序列，即引物序列不能检测到所有Hobi-like瘟病毒的典型毒株，会造成漏检，而且需要昂贵的荧光定量PCR仪，临床实用性差。

中国专利CN101696453B公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法，它涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。而且该试剂盒需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段中国畜牧业发展状况的问题。方法：首先设计引物，然后配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成。使用方法：取含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入反应液，混合后进行逆转录环介导等温扩增反应，再离心检测；或加入10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外灯下检测；或进行电泳检测；或采用Real-time PCR仪进行保温反应检测。但是，该专利试剂盒只能检测BVDV-1型毒株，并不能检测HoBi-like瘟病毒，而且采用紫外检测或者电泳检测，仍然不能直接肉眼观察，操作成本高。

发明内容