[发明专利]一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，其特征在于：包含TaqMan探针，PCR检测引物或该引物的衍生序列，PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照,

2.根据权利要求1所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述引物的衍生序列，是指在上述序列的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

3.根据权利要求1所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂为pfu DNA扩增酶、dNTPs和缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为牛支原体标准株基因组或携带牛支原体基因的克隆质粒，优选为pMD19-T-TU；所述阴性对照为不含牛支原体基因的pMD19-T空载体质粒。

5.根据权利要求1所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括实时荧光定量反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10S，60℃退火30S，共40个循环。

6.如权利要求1-5之一所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒使用方法，其特征在于：

[1]待检样本PCR模板的制备方法：

(1)取支原体培养物、组织匀浆液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取试剂盒提取总DNA备用；

[2]牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒反应体系组装：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探针1μL；

(2)加入已制备好DNA模板2μL，用灭菌双蒸水补至25μL；

[3]PCR扩增参数为：

(1)94℃预变性5min；

(2)94℃10s,60℃31s；循环数40，每个循环结束检测荧光值；

[4]检测结果判定:

阳性对照Ct值小于20，阴性对照无Ct值，说明试剂盒、操作过程均正常，实验成立；待检样本Ct值小于30，判为牛支原体核酸阳性；待检样本Ct值大于30，牛支原体核酸阴性。