[发明专利]MT基因作为防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及MT基因的新用途，具体地指MT基因作为防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因的应用。

背景技术

饲料中黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)污染普遍存在，严重损害动物的健康，降低动物的生产性能，并造成畜产品中黄曲霉毒素的残留，给畜产品的食用安全带来极大隐患。雏鸭是常见畜禽中对AFB₁最敏感的物种之一。动物经口摄入AFB₁后主要蓄积与肝脏，同时，肝脏也是生物活化AFB₁为高毒性AFB₁-外8,9-环氧化物(AFBO)的场所，是AFB₁危害的主要靶器官，且雏鸭的肝脏损伤具有典型的病理学变化特征。因此，雏鸭原代肝细胞是研究AFB₁毒性的理想模型。DNA被AFBO烷基化形成AFB₁-8,9-二氢二醇，导致了G→T的突变，被认为是AFB₁引起的主要突变(Bedard and Massey,2006)。此外，AFB₁还能诱导肝脏产生活性氧自由基(ROS)，如超氧阴离子自由基、过氧化氢和脂质过氧化物，它们是羟基自由基的前体物质(Halliwell and Gutteridge,1999)，而羟基自由基能攻击DNA上的糖、嘧啶以及嘌呤，而引起DNA氧化损伤，甚至突变(Bedard and Massey,2006)。然而，有限的研究发现，AFB₁诱导ROS的形成，需要细胞色素P450酶(CYP450)催化形成的AFBO和/或水解产生的AFM₁的参与外，还同时需要铁离子参与催化过程和Kupffers细胞的参与(Shen et al.,1996；Towner et al.,2003)。但是，目前关于AFB₁引起的氧化应激导致肝脏损伤的机制尚不清楚。

AFB₁致鸭肝脏损伤与其诱导机体抗氧化能力损伤有关。鸭AFB₁中毒造成的肝脏损伤尚无有效的治疗或缓解方法，主要原因在于哪些关键基因参与AFB₁诱导鸭肝脏毒性尚不清楚。

发明内容

本发明针对现有技术对防治AFB₁致家禽肝脏毒性的不足，提供了一种MT基因(金属硫蛋白基因)作为防治AFB₁致动物肝脏损伤靶标基因的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种MT基因作为防治AFB₁致动物肝脏损伤靶标基因的应用，所述MT基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述MT基因的编码金属硫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

金属硫蛋白(metallothionein,MT)的分子功能主要是结合金属离子，在重金属脱毒反应中发挥重要作用(Margoshes and Vallee,1957)，同时，越来越多的研究揭示了MT能缓解氧化应激、致癌原对机体的损伤(Shibuya et al.,2008；Fujiwara and Satoh,2013)、参与细胞凋亡。MT1/2敲除小鼠对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和LPS/半乳糖胺极敏感，动物接触后表现为急性肝功能衰竭(Kimura et al.,2001；Inoue et al.,2006)。

本发明运用鸭原代肝细胞为模型，通过鸭原代肝细胞过表达MT基因，检测MT基因在调控AFB₁致鸭肝脏毒性作用中的功能。通过MTT试验、细胞凋亡试验、Western blotting和q-PCR技术，以及检测鸭原代肝细胞内抗氧化能力相关指标和肝细胞中AFBO-DNA含量的变化情况，结果表明MT能有效抑制AFB₁致雏鸭肝脏原代细胞损伤的功能，主要通过增强细胞的抗氧化能力、减少AFBO-DNA的生成、及调控抑癌因子和促凋亡相关基因的表达，进而抑制AFB₁诱导的肝细胞癌变和凋亡。说明了MT基因在抑制AFB₁毒性上作用。

通过上述研究发现，AFB₁诱导雏鸭肝脏毒性过程中，能极显著下调MT基因的表达，而鸭原代肝细胞过表达MT可极显著抑制AFB₁致肝细胞毒性。因此，确定MT基因在AFB₁致雏鸭肝脏损伤中起到关键作用。