[发明专利]一种α-2，3脱氨基唾液酸乳果糖制备方法

说明书

本发明公开了一种α‑2，3脱氨基唾液酸乳果糖的制备方法，其特征在于：甘露糖40～80重量份，丙酮酸钠100～200重量份，乳果糖50～100重量份，三磷酸胞苷钠(CTP)125～260重量份，溶于4000～8000重量份超纯水中，用4摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入400～1000重量份1摩尔/升的pH8.5的Tris‑HCl；加入40～100重量份2摩尔/升的MgCl₂；加入5～8重量份唾液酸醛缩酶，6～10重量份的CMP‑唾液酸转移酶；6～10重量份的α‑2，3唾液酸苷转移酶。然后在37℃气浴振荡器反应24小时。待乳果糖反应完全后，往反应液中加相同体积95％乙醇，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。采用生物胶柱纯化，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为纯品。

技术领域

本发明属于功能性寡糖制备技术领域，具体涉及一种α-2，3脱氨基唾液酸乳果糖制备方法。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)是一类带羧基的九碳单糖化合物酰基衍生物的总称，广泛存在于细菌、鱼类、哺乳动物等多种生物体内，通常在动物细胞表面糖蛋白质和糖脂的糖链末端，参与并调节许多重要的生命活动，如细胞识别、生物膜流动和细胞内吞作用等，是高等动物和某些微生物具有的重要分子。现已知的唾液酸成员近50多种，其中，N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(KDN)是唾液酸的三种核心单体，其余的唾液酸均由这三种单体衍生而来。

脱氨基唾液酸(KDN)是唾液酸家族中的三种核心成员之一，可由甘露糖作为前体合成得到。脱氨基唾液酸大量存在于低等脊椎动物和细菌中，而在哺乳动物中的表达量却很低。有研究报道，脱氨基唾液酸在人类肿瘤中高度表达，并且与肿瘤恶性程度呈正相关，因此，KDN可能是某些肿瘤的肿瘤标示物。

近年来的研究表明，唾液酸及其衍生物在抑制唾液酸酶与抗流感病毒、抗腺病毒、抗副流感病毒、抗呼吸道合胞病毒、抗轮状病毒等方面具有重要作用。近来有人提出了“唾液酸组”的概念，是指为特定的种属、器官、组织、细胞或亚细胞表达的唾液酸种类和链接的总和。以唾液酸为先导合成和筛选生物活性物质方面的研究比较活跃，尤其在抗老年痴呆、抗癌转移、抗炎、抗病毒等方面的研究已经取得了较大进展，发现了一些毒副作用小、作用机制独特的化合物。许多危害人类健康疾病如脑膜炎、流感、牙周疾病等发病机制均与病原体分泌的唾液酸酶或唾液酸糖基转移酶有密切关系，对唾液酸生物学活性的研究将可能成为糖生物学研究热点，唾液酸寡糖也不断以全新的姿态展现在人们的视野中。目前，唾液酸在市场上主要用于治疗神经性疾病和老年痴呆症。而且唾液酸的抗识别作用是其参与细胞识别的一种方式，有一定的生理和病理意义。如唾液酸具有一定程度治疗癌症的效果，可将癌细胞从人体中提取出来，用特定的酶除去细胞表面的唾液酸，在重新注入体内，使人体内原有的癌细胞解体或消失。但是目前国内的唾液酸市场主要依靠进口，国内还没有出现大规模的生产厂家。所以对唾液酸及其寡糖的研究技术在我国显得尤为重要。

目前国内的脱氨基唾液酸寡糖还没有出现大规模的生产厂家，甚至连能够正常生产的厂家也非常少。由于起步较晚，没有掌握生产羟乙酸唾液酸寡糖的核心技术，而且国内生产的唾液酸在质量和价格上也与进口的产品有一定的差距。本发明以有乳果糖为母体进行α-2，3脱氨基唾液酸糖苷化，得到的新型α-2，3脱氨基唾液酸乳果糖是很有潜力的活性寡糖，对它们的功能性研究具有非常重要的科学和民生意义。正是根据市场的需求，经过不断实验和探索，我们发明了一种α-2，3脱氨基唾液酸化乳果糖制备方法。

发明内容

本发明目的是克服了用化学方法对乳果糖进行脱氨基唾液酸糖基化比较困难的问题。这是因为唾液酸糖苷化反应条件较一般糖苷化反应苛刻，立体选择性通常较差，端基碳的立体构型较难控制，唾液酸糖苷化反应产率差，很难制备。利用最近发展的酶法对乳果糖进行羟乙酰唾液酸糖基化修饰，利用高效的酶法合成制备技术，能够成功的制备出一种α-2，3羟乙酰唾液酸乳果糖。

本发明的技术方案是：