[发明专利]一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤免疫领域，涉及肿瘤细胞裂解液，具体涉及一种细胞裂解液、裂解试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

免疫治疗是手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方式，在肿瘤的综合治疗模式中，免疫治疗在提高肿瘤治愈率、改善患者生活质量、延长生存期方面起重要作用。在肿瘤免疫中，T淋巴细胞识别的肿瘤抗原不是被肿瘤细胞提呈，而是被抗原提呈细胞提呈。树突状细胞(DC)是人体内目前已知功能最强大、唯一能激活静息状态T细胞的抗原提呈细胞，具有强大的激活辅助和细胞毒T细胞的能力。树突状细胞肿瘤疫苗是肿瘤治疗的第四模式之一，有望成为一种很有实用前景的抗肿瘤方法。肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗是由树突状细胞经肿瘤细胞裂解物或完整肿瘤细胞(两种最常用的全细胞抗原)致敏形成，致敏树突状细胞能表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子，使疫苗的抗肿瘤作用明显提高。

将树突状细胞与肿瘤细胞裂解物共同培养得到的致敏树突状细胞称为裂解物致敏DC疫苗；将树突状细胞与完整肿瘤细胞进行细胞融合得到的疫苗称为融合疫苗。相对而言，裂解物致敏DC疫苗技术难度相对较小，易于操作。肿瘤细胞裂解物的获得方法主要有两种：化学裂解和物理裂解。物理裂解包括反复冻溶法(又称为热休克法)和超声波处理法。化学裂解包括裂解液裂解和酶裂解。四种方法比较而言，超声波处理法最为剧烈，容易造成DNA断裂和蛋白质变性；酶裂解用在裂解物致敏DC疫苗方面最容易破坏肿瘤细胞裂解物，降低抗原性；反复冻溶法最为温和，裂解效率也高，但是冻溶裂解需要将肿瘤细胞于-80℃和37℃反复冻融4个循环以上，操作耗费时间，且不易商品化、标准化；裂解液裂解比超声波处理法温和，没有酶裂解法对肿瘤细胞裂解物破坏性强，比冻溶裂解法快捷方便，唯一的不足就是还是会一定程度上造成肿瘤细胞裂解物中抗原成分高级构象的破坏，降低抗原性。现有技术中，为了最大限度保留肿瘤细胞裂解物中蛋白的抗原性，冻溶裂解法较为常用，如赵增仁等采用液氮反复冻融法制备人胃癌OCUM-2MD3肿瘤抗原(肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率，第四军医大学学报)，古涛等采用-80℃和37℃反复冻融4个循环再离心取上清的方法制备小鼠骨髓瘤SP2/0细胞裂解物(肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究，中国病理生理杂志)。

因此，如果能开发一种对肿瘤细胞裂解效率高且能最大限度保持裂解物抗原性的裂解液，裂解液裂解法必将取代冻溶裂解法而一枝独秀！

细胞裂解液的主要目的包括如下两个方面：(1)破坏脂质双分子层，使细胞破裂；(2)抑制蛋白酶活性，防止蛋白被蛋白酶水解。因此，现有技术中，各大实验室自行配制的细胞裂解液或市售的细胞裂解液试剂盒主要包含以下成分：多种细胞裂解成分和蛋白酶抑制成分。当然还有其他一些成分。裂解液中常添加的化学成分有：Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系)、NaCl(等渗体系)、EDTA(变性剂和稳定剂)、Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)、SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)、PMSF(强大的蛋白酶抑制剂)、Aprotinin(蛋白酶抑制剂)、Leupeptin(蛋白酶抑制剂)、脱氧胆酸钠(强去污剂，破坏细胞膜)、Triton X-100(非离子型表面活性剂，破坏细胞膜)、CHAPS(离子型表面活性剂，破坏细胞膜)。添加蛋白溶解剂的一般主要目的是为了获得裂解液中的核酸，而不太在乎抗原等蛋白质成分。