[发明专利]呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、人工抗原的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种呋喃唑酮代谢物的半抗原，其特征在于，为如下结构式Ⅲ：

2.一种呋喃唑酮代谢物的半抗原的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(a)将化合物Ⅰ溶解于乙醇中，通过氢氧化锂溶液将PH值调至10-11，反应获得化合物Ⅱ；

所述化合物Ⅰ的结构式为：

所述化合物Ⅱ的结构式为：

(b)将所述化合物Ⅱ与呋喃唑酮代谢物在甲醇条件下反应，既得所述呋喃唑酮代谢物的半抗原；其为如下结构式Ⅲ：

3.一种呋喃唑酮代谢物的半抗原的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(a’)将化合物Ⅰ溶于乙醇中，通过氢氧化锂溶液将PH值调至10-12，进行反应，加入纯化水，用稀盐酸将PH值调至4～5，过滤，得到化合物Ⅱ，所述化合物Ⅰ反应生成所述化合物Ⅱ的过程如下：

(b’)将所述化合物Ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩尔当量的呋喃唑酮代谢物AMOZ，在60～70℃进行反应，反应完毕，过滤，既得所述呋喃唑酮代谢物的半抗原；所述半抗原的结构式III及其合成路线如下：

4.一种呋喃唑酮代谢物的人工抗原，其特征在于，是载体蛋白与所述呋喃唑酮代谢物的半抗原偶联得到的偶联物，其为如下结构式IV：

5.根据权利要求4所述的呋喃唑酮代谢物的人工抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

6.一种呋喃唑酮代谢物的的人工抗原的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取权利要求1所述的呋喃唑酮代谢物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺中，搅拌后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其中，所述半抗原、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为5：4：3，室温下搅拌，既得半抗原活化酯；

(2)称取载体蛋白，所述载体蛋白与所述半抗原的摩尔当量比为30：1，使所述载体蛋白充分溶解在PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将所述半抗原活化酯滴加至所述载蛋白溶液中，搅拌；

(3)将步骤(2)所得溶液通过PBS溶液室温透析，既得。

7.根据权利要求6所述的呋喃唑酮代谢物的人工抗原的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

8.一种通过权利要求4所述的呋喃唑酮代谢物的人工抗原制备的单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤如下：

(i)以权利要求4所述的呋喃唑酮代谢物的人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠；

(ii)取所述步骤(i)处理后的小鼠尾部静脉血检测血清效价，如抗体效价不达60000，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg免疫原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠的脾细胞与SP20细胞融合；

(iii)融合后的细胞在HAT培养基中筛选，然后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养；

(iv)用ELISA对所述步骤(iii)处理后的细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；

(v)将所述杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，既得。

9.权利要求4所述的呋喃唑酮代谢物的人工抗原和权利要求8所述的单克隆抗体在检测呋喃唑酮代谢物中的应用，其特征在于，步骤如下：将权利要求4所述的人工抗原作为包被原包被在酶标板上，将权利要求8所述的单克隆抗体加入微孔板中；采用竞争法检测待检样本中呋喃唑酮代谢物的含量。

10.权利要求8所述的单克隆抗体在检测水产品中呋喃唑酮代谢物残留分析中应用。