[发明专利]一种TrxA和SUMO双促溶表达标签序列及应用

说明书

本发明涉及基因重组和蛋白质原核表达领域，具体说是一种大肠杆菌硫氧还蛋白TrxA和小泛素样修饰蛋白SUMO融合形成双促溶表达标签序列及其在原核表达载体中的应用。所述的SUMO和TrxA双促溶表达标签，具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列。将该序列应用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因同时融合表达，可以显著促进所表达的外源蛋白的可溶性，提高了可溶性外源蛋白的回收效率。

技术领域

本发明涉及基因重组和蛋白质原核表达领域，具体说是一种双促溶原核表达标签，由大肠杆菌硫氧还蛋白TrxA和小泛素样修饰蛋白SUMO串联组成，将其用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，以促进所表达的外源蛋白的正确折叠，增强可溶性。

背景技术

由于原核表达系统缺乏适当的翻译后加工机制，所以在大肠杆菌为宿主菌表达外源蛋白过程中，会因不正确的蛋白折叠而形成不溶性的包涵体，需要再次经过复杂的变性复性处理，很难表达大量的可溶性外源蛋白。

大肠杆菌硫氧还蛋白TrxA具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可帮助蛋白质正确折叠，共表达可以增加外源蛋白的可溶性，并且在TrxA下游还有一个肠激酶位点，表达后使用肠激酶切下Trx，保证表达外源蛋白的生物学功能，但其切割效率较低，且促溶效果不甚理想。

小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Small ubiquitin-like modifier),是一种分子伴侣,具有同泛素相似的结构(β-折叠片缠绕一个α-螺旋的球状折叠)，保守存在于真核生物中，参与蛋白质翻译后修饰等多种生理进程。因为其具有一个高度疏水的核心，能为融合蛋白的折叠提供成核位点，从而作为分子伴侣和融合标签用于提高外源蛋白稳定性和可溶性，且SUMO蛋白三级结构能够被SUMO蛋白酶完整识别，经过特异性的酶切后的目的蛋白具有天然的N末端，保证了目的蛋白的活性。在表达水平和产物的可溶性方面SUMO表达系统明显优于传统表达系统。

本发明在大量生物信息学模拟分析，多种序列组合的设计和实际生物学活性筛选结果的基础上，设计了一种TrxA和SUMO融合形成双促溶表达标签序列，将该序列置于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因融合表达，可以显著促进所表达的外源蛋白的正确折叠，提高所表达的外源蛋白的可溶性。

发明内容：

本发明目的是设计一种TrxA和SUMO双促溶表达标签序列，并将该序列应用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因同时融合表达，以提高所表达的外源蛋白的可溶性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种TrxA和SUMO双促溶表达标签序列，具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列。

所述TrxA和SUMO双促溶表达标签的构建,是通过PCR技术将SUMO基因克隆，并在其两端增加Kpn I和Nco I限制性内切酶位点；

采用引物：

F:5’–CGGGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAAT-3’

R:5’–CAGTCCATGGCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3’

通过PCR技术扩增出SUMO的基因片段；

利用限制性核酸内切酶Kpn I和Nco I的酶切连接技术将PCR扩增获得的SUMO基因连接入pET32a表达载体Trx基因的下游和多克隆位点((multiple cloning site,MCS)的上游区(替代原pET32a表达载体212位至238位的碱基序列)，构建成一种TrxA和SUMO双促溶表达标签序列，使在同一质粒载体中，利用Trx与SUMO以融合形式双表达，促进外源蛋白可溶性表达。

本发明具有如下优点：