[发明专利]一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法

说明书

本发明提供了一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法，本发明的原位杂交探针Oligo‑442A01可用于标记大麦染色体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并对该核苷酸进行荧光标记用于构建探针。利用该探针与(AGG)₅组成的探针组合在不需进行染色体变性的条件下，能有效识别大麦染色体组，是一种较好的识别、区分大麦染色体组的探针组合方法。本发明提供的探针及方法能准确地标记与识别大麦染色体组，对分析大麦染色体形态及行为具有较好效果，在大麦分子细胞学及染色体工程育种领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及大麦染色体原位杂交(FISH)过程中寡核苷酸的确定与应用，本发明还涉及利用本发明提供的寡核苷酸探针对大麦开展非变性荧光原位杂交(ND-FISH)反应体系的建立与对大麦染色体组鉴定的应用。

背景技术

高等生物染色体复结构杂，在不同染色体区域存在大量的重复序列，基于这一特性，在分子细胞遗传学领域通常通过标记重复序列用于鉴定染色体。其是通过对重复序列进行荧光标记标记制备探针，使用染色体原位杂交方法分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。进一步地，染色体原位杂交方法在染色体工程育种中也起着至关重要的作用，染色体原位杂交方法是鉴定、区分特定物种基因组与染色体组最有效、直接的方法之一。

目前，已经报道的大麦亚端粒探针仅有Hv01，其是通过扩增大麦基因组亚端粒重复序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通过标记扩增目标序列流程复杂，耗时费力，且受多种因素影响使得标记效果往往不理想。尤其是在进行大量试验操作时，这一方法将在很大程度上影响试验进程与效果。同时，通过标记扩增目标序列开展染色体原位杂交实验的方法需要对目标材料染色体进行变性处理，不仅增加了试验流程，同时在处理过程中易对载玻片上的染色体位置产生位移。当前，ND-FISH技术逐步兴起，替代传统的FISH试验方法。其可通过设计合适的寡合苷酸探针，在不变性的条件下直接对目标材料染色体进行标记，极大地精简了实验步骤、缩短了试验时间，同时保证了试验效果。因此，提供一条能稳定标记大麦亚端粒区域的核苷酸探针将有助于解决当前原位杂交试验中标记大麦亚端粒区域所面临的困境。

发明内容

为克服现有技术上的不足，本发明提供一种能稳定标记大麦染色体组的寡核苷酸探针以及该探针结合其他寡核苷酸探针通过ND-FISH方法鉴定大麦染色体组的应用。

基于以上目的，本发明根据Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)对大麦染色体亚端粒区的研究结果确定引物：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用该引物对栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027全基因组DNA进行PCR扩增反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现其产物存在如图1所示的4条较亮条带。选取其250bp左右条带回收并构建质粒进行测序，结果显示，其序列长度为113-116bp，说明所回收的核苷酸中存在两个前后相连的相似性极高的片段。利用NCBI数据库对测序结果Baudin 1进行序列比对分析，检测出其在一段全长为105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登录号为AC256248.1)上存在64个拷贝。将HV_Mba442-A01分成小片段后反复在NCBI数据库中与其自身比对，最终确定一段相对保守的全长为55bp的核苷酸用于探针制备，其碱基序列为：