[发明专利]一种基于RPA技术的马尔堡病毒检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA技术的马尔堡病毒检测试剂盒及其应用。

背景技术

马尔堡病毒(Marburg virus)属于丝状病毒科马尔堡病毒属，主要流行于非洲，可引起严重的出血热症状，传染性强，病死率为23-90％。以急性发热伴有严重出血为主要表现特征。目前中国尚未出现马尔堡病毒感染病例，但随着全球贸易、旅游业的飞速发展，不同国家、不同地区的人类交流日益频繁，很多传染病已打破了地区、国界的限制，传播范围日益广泛，我国也多次面临输入性传染病的威胁。我国人口多，人口密度大，马尔堡病毒一旦传入我国，后果不堪设想。为了应对今后可能出现的马尔堡病毒感染，极有必要研制马尔堡病毒快速检测试剂。

人类目前针对马尔堡病毒的检测主要依靠实时荧光定量PCR技术，需要昂贵的温控设备、特定的实验室场地和专业技术人员操作，且检测时间长，不适用于突发传染病的现场快速检测，因此，建立一种快速简便的核酸检测技术，对马尔堡病毒的及时发现和鉴别具有重要的意义和价值。

重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是由Piepenburg等人建立的一种新型核酸等温扩增技术，该技术主要依赖于三种酶：结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶UvsX、单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶，模拟体内DNA复制的酶反应过程对DNA模板进行扩增。在恒温37℃-42℃之间，核酸模板无需变性，20分钟之内即可完成整个扩增过程。同时，RPA技术操作简单，设备要求低，具有灵敏度高、特异性强等特点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种检测或辅助检测马尔堡病毒的成套引物。

本发明提供的检测或辅助检测马尔堡病毒的成套引物由引物1、引物2和探针组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；

所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：

d1)序列4所示的单链DNA分子；

d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套引物中，

所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔量比为7:7:2。

上述成套引物中，

所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T；所述荧光基团可为FAM、6-FAM、FITC、HEX、JOE、Phosphate、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Rhodamine B、ROX、TAMRA、NBD、TET或DyLight 770，所述荧光基团具体为FAM；

所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T；所述淬灭基团可为DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为BHQ1。

上述成套引物中，所述探针中的DNA片段乙的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端外切酶和聚合酶发挥作用。

本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测马尔堡病毒的RPA试剂。

本发明提供的检测或辅助检测马尔堡病毒的RPA试剂包括上述成套引物。

上述RPA试剂中，

所述引物1和所述引物2在所述RPA试剂中的终浓度均为0.42μM；

所述探针在所述RPA试剂中的终浓度为0.12μM。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测马尔堡病毒的试剂盒。