[发明专利]人源肝细胞中Nrf1α基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，具体涉及人源肝细胞中Nrf1α基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用。

背景技术

核因子E2相关因子1(TCF11/Nrf1)具有抗氧化、抗炎症、调控蛋白质降解、糖脂代谢平衡等多种重要生理功能。但由于细胞中Nrf1蛋白存在多个亚型包括Nrf1α、Nrf1β、Nrf1χ、Nrf1D等以及多种翻译后修饰，使得Nrf1的功能未能得到透彻的研究。肝细胞系是研究Nrf1调控糖脂代谢的良好材料，目前市面上还未见有人源肝细胞系Nrf1敲出的细胞系出售，使得Nrf1对糖脂代谢调控的具体分子机制和信号通路比较模糊。

传统的研究方法中，使用siRNA干扰技术研究Nrf1功能的原理是通过降解细胞中Nrf1的mRNA，从而达到降低细胞中Nrf1蛋白质水平，而且不能完全消除细胞中的Nrf1，因此得出的研究结果不能排除残留的Nrf1蛋白的影响，此外siRNA技术还存在脱靶问题，siRNA技术的稳定性以及可重复性较差；利用同源重组系统基因敲出技术研究Nrf1则是在基因组上将Nrf1基因全部敲出，但此方法操作繁琐，在基因组上敲出片段较长可能导致转录失控，并且不能区分不同Nrf1亚基的功能。

如何使Nrf1的研究变的方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变得遗传背景下达到Nrf1全部敲出，并且让研究结果稳定可靠可重复，是Nrf1研究领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：如何提供人源肝细胞中Nrf1 α基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用，使该方法操作方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变的遗传背景下达到将Nrf1 α蛋白全部敲除，使肝细胞中不残留Nrf1 α蛋白的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于Talen的人源肝细胞中Nrf1α基因定向敲除识别序列对，所述识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成；所述左臂识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述右臂识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1α基因的转录激活样效应因子核酸酶Talens，所述转录激活样效应因子核酸酶Talens由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的核酸酶左臂Nrf1α-Talen L和识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的核酸酶右臂Nrf1α-Talen R组成；所述Nrf1α-Talen L由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的Tale-L和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成，所述Nrf1α-Talen R由识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的Tale-R和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成；所述Tale-L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tale-R的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1α基因的载体对，所述载体对由Nrf1α-Talen L载体和Nrf1α-Talen R载体组成；所述Nrf1α-Talen L载体包含编码所述Tale-L的核苷酸序列，所述Nrf1α-Talen R载体包含编码所述Tale-R的核苷酸序列；所述Nrf1α-Talen L载体或Nrf1α-Talen R载体带有嘌呤霉素抗性基因。

进一步，所述Nrf1α-Talen L载体为包含编码所述Tale-L的核苷酸序列的TALEN-LEFT载体；所述Nrf1α-Talen R载体为包含编码所述Tale-R的核苷酸序列的TALE-RIGHT载体。

所述用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1α基因的载体对在定向敲除人源肝细胞系中Nrf1α基因、构建Nrf1α基因敲除型人源肝细胞系中的应用。

进一步，所述人源肝细胞为人源肝癌细胞系HepG2细胞和人源肝细胞HL7702细胞。

Nrf1α基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，包括如下步骤：

1)采用转染法将所述载体对转染入人源肝细胞中；

2)用嘌呤霉素筛选步骤1)转染培养后的人源肝细胞，得到成功转染Nrf1α-Talen L载体质粒和Nrf1α-Talen R载体质粒的人源肝细胞；

3)将步骤2)筛选成功的转染Nrf1α-Talen L载体质粒和Nrf1α-Talen R载体质粒的人源肝细胞用胰酶消化悬浮后，继续培养至单细胞克隆长成，挑取由单个细胞长成且细胞状态良好的群落继续扩大培养，得到所述Nrf1α基因敲除型人源肝细胞系。