[发明专利]金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域,涉及一种狗尾草农杆菌高效转化方法,具体是一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法。

背景技术

C4光合作用是驱动几种主要粮食作物和生物能源草类的生产力，包括玉米(Zea mays)、甘蔗(Saccharum officinarum)、高粱(Sorghum bicolor)、芒草(Miscanthus giganteus)和柳枝稷(Panicum virgatum)等。狗尾草(Setaria viridis)是一个真正的二倍体，具有许多适于遗传分析的特性，包括相对较小的基因组(510Mb)，身材矮小，生命周期短和种子量大等等，因此，狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型，同时也是研究非生物胁迫耐受性和生物能源原料的模型。狗尾草在形态上类似于大多数禾本科草，包括主要生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)和芒草(Miscanthus giganteus)等，在地理上广泛分布，并且占据多样化的生态位。

目前，狗尾草的转基因技术主要采用成熟种子发芽后，从幼芽节点分生组织处诱导胚性愈伤组织进行农杆菌转化，这种方法的最大问题是胚性愈伤组织诱导率低，因品系和种子状况不同，一般胚性愈伤组织诱导数与种子数的比率都小于10％；其次是胚性愈伤组织诱导时间较长，从接种子到培养基获得第一阶段的少量胚性愈伤组织需要约一个月时间，之后需要继代2次(每半月继代一次)后才有足够的胚性愈伤组织用于农杆菌转化，整个转化周期需要约4个月时间；同时，这种胚性愈伤组织不耐继代，不能长期继代保存用于转化，继代3次以上的胚性愈伤组织转化效率明显降低，不适合继续用于转化；此外，胚性愈伤组织的挑选需要有一定的经验。这些都降低了这套转化技术的灵活性和简单实用性。作为重要的模式植物，为狗尾草建立更简单、灵活、周期短、高效的转基因技术已成为相关领域的研究方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，以狗尾草成熟种子为外植体，诱导露芽后用金刚砂进行创伤处理，处理后用农杆菌进行浸染，经共培养、抑菌、筛选与植株再生得到转基因植株，具有简单、灵活、快速、高效等特点。

本发明所采用的技术方案：

一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，其具体步骤如下：

1、外植体的处理和活化

选取经休眠处理的狗尾草干燥成熟种子，将去除种皮后的种子装入离心管，用有效浓度为1～3％的次氯酸钠溶液灭菌消毒处理，无菌水清洗后，按质量体积比：种子：芽诱导液体培养基＝1:6～8的比例在离心管中加入芽诱导液体培养基，振荡培养1～7天，培养条件：光培养，培养温度24～26℃。所述芽诱导液体培养基是以MS培养基为基础培养基，其中微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，并添加激素；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。

2、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染

按照种子体积称取等量的中等目度的金刚砂(即按体积比：种子：金刚砂＝1:1)，高温灭菌处理，倒掉离心管中的芽诱导液体培养基，加入金刚砂,然后加入少量含有0.6～1.0OD_600nm农杆菌的浸染培养基,在涡旋振荡器下高速处理2～3分钟，再加入含农杆菌的浸染培养基，使含农杆菌的浸染培养基的总体积为种子体积的8～12倍(即按体积比：种子：浸染农杆菌液＝1:8～12)，低速振荡浸染0.5～1小时，培养条件：光培养，培养温度24～26℃。所述浸染培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，PH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L、表面活性剂0.1～1％(如Synperonic,质量体积比)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。

3、共培养

将浸染后的种子接到带滤纸的共培养培养基上，暗培养3～9天，培养温度在20～28℃之间(可根据使用的不同农杆菌菌株进行调整)。所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。

4、抑菌和筛选培养