[发明专利]一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法

权利要求书

1.一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（一）取表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒溶液，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散表面羧基化的二氧化钛纳米颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入聚醚酰亚胺（PEI）的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，用碳酸盐缓冲液清洗反应后的二氧化钛纳米颗粒，本步骤利用聚醚酰亚胺（PEI）将二氧化钛纳米颗粒表面的羧基官能团氨基化；

（二）将步骤（一）得到的表面氨基化的二氧化钛纳米颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（t-Boc-NH-PEG-3000-NHS）碳酸盐缓冲液中，充分反应后用超纯水清洗，得到表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒；

（三）将步骤（二）得到的表面聚乙二醇化的二氧化钛纳米颗粒加入到适量的三氟乙酸中，超声振荡，反应一段时间后，用磷酸盐（PBS）缓冲液清洗脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒；

（四）将步骤（三）得到的脱Boc后的二氧化钛纳米颗粒，加入蛋白交联剂4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中进行反应，得到修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒；

（五）在Ep-CAM抗体溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），反应一段时间；

（六）将步骤（五）反应得到的Ep-CAM抗体溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应后，用脱盐柱脱去Ep-CAM溶液中的盐；

（七）将步骤（四）得到的修饰有蛋白交联剂的二氧化钛纳米颗粒，加入Ep-CAM抗体溶液，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液清洗，得到二氧化钛纳米颗粒复合物，在4 ℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（一）中所用羧基化的二氧化钛纳米颗粒为实心二氧化钛纳米颗粒、二氧化钛纳米棒，二氧化钛纳米笼，二氧化钛纳米壳球体，粒径为1-100 nm，浓度为0.01-2 nmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（一）和步骤（二）中所用碳酸盐缓冲液为pH条件为8.2的0.05 moI/L碳酸钠水溶液，步骤（一）中所用聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液浓度为2%-20%，反应时间为1-4 h。

4.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（二）中所用的t-Boc-NH-PEG-3000-NHS碳酸盐缓冲液中PEG浓度为l-40 mmol/L，反应时间为1-3 h。

5.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（三）中与三氟乙酸反应时间为5-10 min。

6.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（四）中所用的蛋白交联剂SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超纯水中，然后再将SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS缓冲液中，浓度为0.2-4 mg/mL，反应时间为10-40 min。

7.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（五）中所用的蛋白修饰试剂SATA或SATP先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，然后再加入到Ep-CAM抗体溶液中，其与Ep-CAM抗体的摩尔比率范围为10:1到250:1，反应时间为0.5-3 h。

8.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（六）中所用的脱乙酰缓冲液为0.5 mol/L羟胺，25 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH7.2-7.5，反应时间为1-3 h。

9.根据权利要求1所述的一种用于循环肿瘤细胞俘获的纳米材料制备方法，其特征在于：步骤（七）中所用的Ep-CAM抗体溶液浓度为1-20 ug/mL，反应时间为1-2 h。