[发明专利]一种特异性引物检测鼠源性成分的方法

说明书

技术领域：

本发明属于动物源性成分检测技术领域，具体涉及一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，利用特异性引物采用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)法检测鼠源性成分。

背景技术：

PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外95℃的高温时变性成单链，在60℃左右的低温时，引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适宜的72℃反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制；聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能够看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，所以，无论是化石中的古生物或历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对；老鼠肉冒充价格昂贵的牛羊肉是一些利欲熏心的商家经常采用的恶劣手段，老鼠肉直接冒充牛羊肉或掺杂在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌，带来了极大的社会影响，对使用者造成巨大的人身伤害，这是因为老鼠自身携带多种病菌，本身就是多种传染病病原的储存宿主和主要传染源，同时，老鼠肉所含的铅和砷等有毒有害物质的含量也远高于其他肉类，直接食用会给人们带来极大的身体危害和疫病传染风险，轻则中毒，重则死亡；目前，尚没有鼠源性成分检测的国家标准或者行业标准，普通消费者乃至食药质监部门通过肉眼难以鉴别，且传统检测方法繁琐，耗时长。本发明旨在通过实时荧光定量PCR核酸检测技术，开发一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，为鼠源性成分的检测提供技术支持，为标准方法的建立提供实验支撑，为打击肉类掺假提供有力的科学依据，具有良好的社会和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，设计一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，为鼠源性成分的检测提供技术支持，为标准检测方法的建立提供实验支撑，为打击肉类掺假行政执法提供有力的科学依据。

为了实现上述目的，本发明涉及的特异性引物检测鼠源性成分的方法的工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤：

(1)、特异性引物设计合成：根据Genba nk中鼠的线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列设计并合成特异性引物，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉组织1g研磨成糜状，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL，纯度为1.85，用RNase/DNase-free(去RNA酶与DNA酶)H₂O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL，备用；

(3)、反应体系建立：以步骤(2)提取的DNA为模板，用特异性引物建立10μL的PCR反应体系，取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture(2×反应混合物)，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O补足，实现反应体系的建立，并设置平行试验；

(4)、PCR扩增：将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置以下条件：①、模板变性：95℃-5min；②、QPCR扩增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40个循环，在72℃时采集荧光信号；③、熔解曲线：95℃-5s，65℃to 97℃的速率为0.5℃/5s，1个循环；

(5)、鼠源性成分分析结果评价：测定并加权计算实时荧光定量PCR产物平均Cp值，Cp值小于33，熔解曲线显示有明显的单一主峰，无非特异性PCR产物，表明利用该特异性引物能够检测到鼠源性成分，且特异性和重复性良好。

本发明涉及的特异性引物根据Genbank(DNA序列数据库)中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成的，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。