[发明专利]一种利用大豆组合苗筛选耐盐基因的方法

说明书

本发明公开了一种利用大豆组合苗筛选大豆耐盐基因的方法，步骤包括大豆籽粒消毒、培养后获取大豆地上部分外植体；对地上部分外植体进行根系的诱导培养，获得组合苗；对完整的组合苗进行盐胁迫，筛选后进行耐盐基因性状鉴定。本发明的方法整体操作简单，效率高，效果好，能够快速筛选大豆耐盐基因，有利于改良大豆种质资源。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种利用大豆组合苗筛选耐盐基因的方法。

技术背景

耕地盐碱化是目前我国农业生产中面临的主要问题之一，其严重影响了我国农业生产及粮食安全。培养耐盐碱的作物新品种是面对盐碱化的有效手段之一，而培育大豆耐盐新品种对于进一步提高大豆产量具有重要意义。筛选耐盐大豆资源并从中寻找耐盐关键基因是培育耐盐材料的快速直接的方法，并对探究大豆耐盐机理具有重要意义。然而由于大豆遗传转化困难，转化率低，转化周期长导致耐盐基因功能鉴定效率低下。

因此本领域的技术人员致力于开发一种简便快速利用组合苗鉴定大豆耐盐基因功能的方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种利用大豆组合苗筛选耐盐基因的方法，在一个具体实施方式中，该方法包括：

1)大豆籽粒经消毒、培养后获取大豆地上部分外植体；

2)对地上部分外植体进行根系的诱导培养，获得组合苗；

3)对完整的组合苗进行盐胁迫筛选，鉴定耐盐基因。

进一步地，步骤1中，挑取成熟饱满表皮无病变的大豆籽粒进行表面消毒后，种植于珍珠岩中并浇灌Hoagland营养液，使其生长至第一对三出复叶完全展开。

优选地，大豆籽粒消毒为使用氯气，在静置条件下消毒16-20小时。进一步优选地，将籽粒在无菌条件下通风10-20分钟。

优选地，珍珠岩使用前需经过10-20分钟消毒，消毒温度为127℃。

进一步地，在大豆植株子叶节下方2-3cm处沿斜下30度角度将大豆植株切断，获得大豆地上部分外植体。

进一步地，在步骤2中，将4-7ml利用1/4MS基础盐(basalt salt)液体培养基重悬的含有待鉴定基因的发根农杆菌k599菌液滴加至岩棉块中，之后将步骤1中获得的大豆植株地上部分外植体下部垂直插入该岩棉块中部，使植株下部没入岩棉块2-2.5cm。

优选地，在步骤2中，岩棉块的大小为3cm×3cm×3cm，其中一面戳一个直径2mm，深度1.5-2cm的孔。

进一步地，在步骤2)中，将插有大豆植株地上部分的岩棉块放入洁净保湿盒中过夜保湿，第二天拿下保湿盒上盖，直到豆苗全部出现萎蔫后，加入无菌1/4MS basal salt溶液，盖上保湿盒，直到豆苗恢复正常状态。适当添加无菌的去离子水保持岩棉块湿润。2周后用镊子轻轻撕下岩棉块，除去非切口处的根，获得大豆组合苗。

进一步地，步骤3中，将获得的大豆组合苗转移到含有灭菌后的蛭石及珍珠岩的小花盆中，加入适当地Hoagland营养液。其中，蛭石/珍珠岩＝3：1，小花盆直径10cm，高9cm。

进一步地，步骤3)中，对大豆组合苗进行盐胁迫处理，对组合苗的地上部分及再生根进行耐盐基因表达鉴定。

进一步地，上述盐胁迫为：每天用50ml 100mmol/L的NaCl溶液浇灌1周，1周后对组合苗的地上部分及再生根进行鉴定。

进一步地，使用大豆品系为东农47，天隆1号。