[发明专利]一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。

背景技术

神经母细胞瘤是发生于交感神经节的恶性肿瘤，由未分化的神经母细胞组成，主要起源于肾上腺髓质、腹膜后、后纵隔，盆腔及颈部交感神经节。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，40％神经母细胞瘤病例在就诊时存在肿瘤转移。研究发现，病人的诊断年龄、疾病程度以及基因改变都影响了神经母细胞瘤的治疗效果。神经母细胞瘤具有很强的异质性，可在不经治疗的情况下自行消退，也可表现极具侵袭的恶性表型，对多种治疗手段没有反应而迅速恶化，因此对神经母细胞瘤的早期诊断十分必要。

目前神经母细胞瘤的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。

近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。

CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。

采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。

目前采用RT-PCR方法检测神经母细胞瘤CTCs的标准还没有完全建立。我们通过检测神经母细胞瘤患者的CTCs特征基因，确定神经母细胞瘤CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物,包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。

针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测方法，通过联合检测PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT1 9个基因实现肿瘤的早期检测。本发明设计和运用靶点特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到98％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测神经母细胞瘤的引物组，包含：

本发明的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。

方法1：PCR方法。

(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；

(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

方法2：荧光定量PCR方法