[发明专利]一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶有效
| 申请号： | 201710012364.5 | 申请日： | 2017-01-09 |
| 公开（公告）号： | CN106636285B | 公开（公告）日： | 2018-04-24 |
| 发明（设计）人： | 傅荣昭;刘立辉;刘滔滔;曹磊 | 申请（专利权）人： | 眉山市新功生物科技有限公司;邦泰生物工程（深圳）有限公司 |
| 主分类号： | C12P33/00 | 分类号： | C12P33/00;C12N9/04 |
| 代理公司： | 四川省成都市天策商标专利事务所51213 | 代理人： | 李静云 |
| 地址： | 620031 四川*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 熊去氧 胆酸 制备 方法 及其 | ||
1.一种熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物，在NADP+、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶来源于Turneriella parva，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO:3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NADP+的浓度为0.1～0.25mg/mL，所述葡萄糖的浓度为30～50mg/mL；
所述7β-类固醇脱氢酶为在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中进行下述突变：G15A+S16K、V38R+V39R、Y154W、K158E或R193Q+A195I后得到的突变体。
2.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：控制所述催化反应在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。
3.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。
4.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化反应结束后，调节pH值为10.5～12.5，除去不溶物，再调节pH值为1.0～2.0，水浴50～60℃，搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。
5.一种7β-类固醇脱氢酶，其特征在于：所述7β-类固醇脱氢酶来源于Turneriella parva，用于催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶为在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中进行下述突变：G15A+S16K、V38R+V39R、Y154W、K158E或R193Q+A195I后得到的突变体。
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