[发明专利]丙酮酸工业量产发酵工艺

权利要求书

1.丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述工艺包括以下步骤：

(1)平板培养：

A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、碳酸钙0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；

B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃-30℃培养，培养时间15h-20h后；

(2)茄瓶培养：

a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨琼脂10-12、碳酸钙2-2.5、氯化铵0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用：

b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；

c.培养条件：28℃-30℃，培养时间15h-20h后；

d.将茄瓶放置1℃-4℃的冰箱内存储备用；

(3)种子摇瓶培养：

I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙2.5-4.5、氯化铵0.5-0.8、氯化镁0.32-0.48、磷酸氢二钾0.2-0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；

II. 3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶-1000ml/瓶；培养温度为28℃-30℃，培养时间22h-24h；

(4)一级种子培养：

①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸钙6.5-8.5、氯化铵1.5-2.8、氯化镁1.32-3.48、磷酸氢二钾1.2-2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；

②采用800L种子罐3-5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐-3000ml/罐；

③培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；

④种子成熟的标准：OD值在40-50之间；

(5)一百五十立方发酵罐培养：

第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、碳酸钙20-25、醋酸钠6-8、消泡剂0.01-0.02、微量元素液3-5mL、维生素液3-5mL，PH用浓度为40mol/LHCL调至5.0-5.5，121℃-125℃连续灭菌；

第二.培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min-150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min-350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min-500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min-700min；40h-56h搅拌转速800r/min-1000r/min；罐压维持在：0.03MPa-0.05MPa。

2.根据权利要求1所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述微量元素液(g/L)：氯化锌3-6、氯化铁15-18、氯化铜0.2-0.3、氯化锰15-18，浓度为1.5mol/LHCL调节PH为5.0-5.0定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌。

3.根据权利要求2所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述维生素液(g/L)：维生素D 0.03-0.04、维生素E 0.003-0.005、维生素B₁ 0.2-0.3、维生素PP 6-8，浓度为1.5mol/L HCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌。

4.根据权利要求1或3所述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述发酵培养基的连消顺序：微量元素溶液、发酵培养基。

5.根据权利要求4述的丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述一级种子培养中，④种子成熟的标准：波长660nm条件下的分光光度计，进行检测细胞浓度，成熟标准为：42-45 。