[发明专利]一种表达人α1‑抗胰蛋白酶的重组细胞株及其应用在审
| 申请号： | 201710011332.3 | 申请日： | 2017-01-06 |
| 公开（公告）号： | CN107058229A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 冀倩倩;郭采平;陆勇军;丁玉江;吴樱丹;张佩;王锦才;张战;黄伟荣 | 申请（专利权）人： | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12P21/02;C12R1/91 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司44102 | 代理人： | 单香杰 |
| 地址： | 518107 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 表达 胰蛋白酶 重组 细胞株 及其 应用 | ||
1.一种表达人α1-抗胰蛋白酶的重组体细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列、AAVS1位点左、右同源臂序列的表达质粒，表达质粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列在所述AAVS1位点的左、右同源臂之间；在表达质粒的筛选标记基因的两侧分别插入一个LoxP序列，且这两个LoxP序列的方向一致，得到改造的表达人α1-抗胰蛋白酶的重组质粒；
(2)将步骤(1)改造的重组质粒和靶向AAVS1位点的CRISPR/Cas9质粒共转染人的体细胞，筛选获得定点整合的体细胞；
(3) 以表达Cre酶的质粒转染步骤(2)获得的定点整合的体细胞，通过Cre/LoxP系统切除筛选标记，筛选获得切除了筛选标记且稳定表达重组α1-抗胰蛋白酶的体细胞株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人的体细胞为HEK293细胞或PER.C6细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述筛选标记为GFP基因和嘌呤霉素基因。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述LoxP序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列、AAVS1位点左、右同源臂序列的表达质粒为Genome-TALER™ 货号为DC-DON-SH01的AAVS1供体克隆载体。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 在Genome-TALER™ 货号为DC-DON-SH01的AAVS1供体克隆载体的筛选标记基因的两侧分别插入一个LoxP序列，且这两个LoxP序列的方向一致，得到改造的表达人α1-抗胰蛋白酶的重组质粒，LoxP序列如SEQ ID NO:4所示；
(2)将步骤(1)改造的重组质粒和靶向AAVS1位点的CRISPR/Cas9质粒共转染人的体细胞，筛选获得定点整合的体细胞，靶向AAVS1位点的CRISPR/Cas9质粒为GeneCopoeia公司的Genome-CRISP™质粒；
(3) 以表达Cre酶的质粒转染步骤(2)获得的定点整合的体细胞，通过Cre/LoxP系统切除筛选标记，筛选获得切除了筛选标记且稳定表达重组α1-抗胰蛋白酶的体细胞株。
7.一种权利要求1至6任一项所述构建方法制备得到的重组体细胞。
8.权利要求7所述的重组体细胞在分泌表达人α1-抗胰蛋白酶中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述分泌表达人α1-抗胰蛋白酶的方法为，培养所述重组细胞株至细胞密度为75%～95%，更换培养基，继续培养20h～28h，收集上清液，即得。
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