[发明专利]间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够分化成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。而始于间充质干细胞的硬骨形成过程在骨构建、骨重建及骨折愈合中扮演着重要的角色。如果间充质干细胞骨形成能力降低，必然导致相应骨骼疾病的发生，例如骨骼发育延迟、骨不连、骨折愈合延迟、骨质疏松症等骨形成障碍性疾病。然而骨形成障碍是一个比较复杂的过程，其相关的分子机理目前还不十分清楚。

微管微丝交联因子MACF1，又名ACF7，是一种新型的细胞骨架交联分子，在细胞极化、细胞迁移、信号转导以及维持组织的完整性中发挥着重要作用。已有研究发现，MACF1与模拟失重条件下骨形成细胞中的微管微丝交联发生改变相关(Qian AR,et al.[J].Bioelectromagnetics,2009Oct.30(7):545–555)；而且，在MACF1稳定低表达的MC3T3-E1前成骨细胞株中，MACF1低表达影响前成骨细胞的形态、抑制前成骨细胞的增殖(Hu LF,etal.[J].BMB Rep.2015Oct.48(10):583-8.)。

可见，MACF1在骨形成中具有重要的作用，只是目前关于MACF1对骨形成作用的研究还非常少，只限于细胞水平。而细胞水平的实验研究仅仅基于离体细胞本身的微小环境，忽视了生命体本身的整体环境及各组织系统间的协调互作。因此，在细胞水平上不能直观全面地研究MACF1在骨形成中的作用。而且，基于现有研究技术，对于MACF1在骨骼中功能的研究，仅构建有在前成骨细胞系MC3T3-E1中使MACF1低表达的稳定细胞株(骞爱荣等.抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用[P].北京：CN 104531700A,20150422.)。

发明内容

为了弥补骨形成研究领域内MACF1基因在间充质干细胞中条件性敲除动物模型的空缺，以在动物水平研究MACF1对骨形成的作用，本发明提供一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用。利用Cre-Loxp系统，通过MACF1^flox/flox小鼠与Cre酶仅在间充质干细胞中特异性表达的Prrx1^Cre小鼠交配，最终获得Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠，成功获得间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除的小鼠模型。所述动物模型的MACF1基因条件性失活，造成所述动物模型中新生小鼠的颅骨发育延迟、成年小鼠的骨形成能力降低，是一种骨骼发育延迟、骨形成能力降低的小鼠动物模型。该模型可以作为研究MACF1基因在骨骼发育及骨形成中功能的动物模型；同时还可用于研究颅骨发育不全以及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病的发病机制，并用于筛选改善或治疗此类疾病的候选物质，具有重要的应用价值。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种间充质干细胞中MACF1基因条件性敲除小鼠模型的建立方法，其特点是包括以下步骤：

(1)选用MACF1^flox/+小鼠自交，扩繁获得纯合子MACF1^flox/flox小鼠；

(2)选用Prrx1^Cre转基因小鼠与SPF级C57BL/6J小鼠交配，扩繁获得Prrx1^Cre转基因小鼠；

(3)将获得的MACF1^flox/flox小鼠与获得的Prrx1^Cre转基因小鼠交配，获得半敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/+小鼠；

(4)将获得的半敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/+小鼠自交，获得间充质干细胞中条件性敲除基因MACF1小鼠模型，即全敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠。

(5)对所得到的MACF1^flox/flox小鼠、Prrx1^Cre小鼠以及Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠利用特异性引物通过PCR方法进行基因型的鉴定。

所述特异性引物为一对时，首选